目的：马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi subsp. zooepidemicus，SEZ）是一种人畜共患病病原，在我国主要引起猪链球菌病。本实验室前期研究发现了一株源于强毒株SEZ ATCC35246自然变异的弱毒株M35246。M35246表现为一个连续25基因的丢失和covS基因的功能丧失性突变。这是第一次发现在SEZ中的涉及covS的自然变异。涉及covS的自然变异是增强化脓链球菌致病性的关键，所以需要确定covS的自然变异是否对SEZ毒力具有相同的影响。本工作的目的是研究CovS在SEZ毒力形成中的作用，有助于研究SEZ的致病机制，特别是涉及SEZ毒力的转录调控机制。

方法：本研究通过转录组测序和DNA测序，确定了M35246中covS的碱基突变形式。在野生强毒株ATCC35246的基础上分别构建了25基因敲除株ΔPI和covS突变株McovS及对应的互补株。随后，本研究检测了ATCC35246、M35246、M35246 CcovS、McovS、CMcovS、ΔPI的生长能力、对上皮细胞HEp-2的黏附能力、对巨噬细胞Raw264.7的抗吞噬能力以及菌体荚膜含量；测定了ATCC35246、M35246、McovS、ΔPI对24种抗生素的敏感性、对小鼠的半数致死量和攻毒后的菌体脏器分布；进行了ATCC35246、M35246、McovS的比较转录组学分析。

结果：M35246中covS的变异导致其移码突变并造成提前翻译终止，且在基因N端形成终止子结构，遏制其转录。与ATCC35246相比，M35246和McovS的荚膜含量和抗吞噬能力显著降低。McovS对β-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类和林可酰胺类药物的敏感性显著高于ATCC35246。与ATCC35246相比，M35246、McovS和ΔPI对小鼠的半数致死量分别增加了10⁵、10⁵和5倍。用约2000倍ATCC35246半数致死量的剂量攻毒48小时后，M35246和McovS均不能从小鼠体内分离。转录组分析表明，McovS和ATCC35246之间存在668个显著差异表达的基因。相对于ATCC35246，McovS中与抗吞噬、荚膜形成、致病性和抗生素抗性有关的许多毒力因子编码基因和合成代谢相关基因显著下调。

结论：本文系统研究了SEZ CovS在细菌抗吞噬作用、荚膜形成、致病性、抗生素耐药性以及对各种重要毒力因子和关键代谢系统转录调控的作用。此外，转录组分析揭示了CovS在抗吞噬作用、荚膜形成、致病性和抗生素耐药性方面的调节机制。

创新性：该工作系统研究了参与SEZ致病性和抗生素耐药的调控因子，表明二元调控系统在不同细菌中调控的多样性，揭示CovS在SEZ毒力形成中起着至关重要的作用。

目的：分析我国鸡源重要致病菌大肠杆菌耐药性及耐药基因，解析潜在的水平扩散风险。方法：规模化养鸡场棉拭子泄殖腔取样，麦康凯培养基分离单菌，Phoenix-100 全自动细菌鉴定/药敏系统鉴定细菌种类，K-B纸片法检测目的细菌药物敏感性，牛津纳米孔测序技术构建细菌基因组精细图，生物信息学软件及平台解析基因环境及水平转移元件，细菌结合实验验证耐药基因扩散风险。结果：2019年10月-2020年10月，共采集671个泄殖腔样本，分离出302株大肠杆菌单菌，鉴定出一株广泛耐药（An extensively drug-resistant, XDR）大肠杆菌（命名为258E）。MLST分析结果表明，大肠杆菌258E属于ST602型，该分型目前仅见于国外文献报道。K-B纸片法检测结果显示，258E菌株对磷霉素、四环素、β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、利福霉素、甲氧苄啶、大环内酯类和头孢菌素类药物均表现出高度耐药。全基因组测序结果表明，大肠杆菌258E染色体全长4,715,664 bp，含有三个质粒（pEC258-1、pEC258-2、pEC258-3）,其中pEC258-1和 pEC258-2不含有常见耐药基因，而pEC258-3除了含有常见耐药基因，如qnrS1、 dfrA14、 arr-3、acc (6')-Ib等，还含有bla_CTX-M-3、 bla_KPC-2、bla_TEM-1B三个重要的耐药基因。质粒分型结果表明，pEC258-3为ST7型，属于质粒不相容群N (incompatibility group N, IncN)。同源性分析结果显示pEC258-3序列与人源肺炎克雷伯菌质粒pCRKP-1-KPC同源性高达99.96%，其不同之处在于：相对pEC258-3，pCRKP-1-KPC质粒在31kb-32kb位点缺失了一个整合酶TinR蛋白编码框。细菌结合实验证实，pEC258-3可使得宿主菌显著提高药物敏感性。同时，流行病学溯源分析结果显示，大肠杆菌258E与英国菌株具有相近的亲缘关系。结论：本研究第一次报道了一株动物源ST602型广泛耐药大肠杆菌，其所含有的质粒可介导宿主菌对多种抗生素产生耐药性，暗示其潜在的耐药性水平扩散风险，也间接证明动物源细菌是耐药性基因的重要储存库和风险传播源头之一。

创新性：本论文是我国第一例动物源ST602型广泛耐药大肠杆菌的报道，丰富和充实了“同一健康” 框架下细菌耐药性对人类公共健康的风险研究。

无乳链球菌是世界范围内引起奶牛乳房炎的最常见病原体之一。了解该菌的流行现状和毒力因子对于制定防治措施至关重要。本研究于2019-2021期间，从中国（n=558）和巴基斯坦（n=603）的多个奶牛场采集了1161份牛奶样本，并对其进行了无乳链球菌的分离鉴定。通过PCR检测分析了无乳链球菌的流行率、血清型、毒力基因和耐药基因。所有的分离菌株均具有溶血、生成生物被膜、细胞毒性、粘附并侵袭牛乳腺上皮细胞的特性。巴基斯坦地区由无乳链球菌引起的奶牛乳房炎的发病率显著高于中国。江苏省和信德省（Sindh）分别是中国和巴基斯坦地区无乳链球菌流行率最高的省份。血清型Ia型和II型的无乳链球菌在这两个国家的流行率均较高，而血清III型的无乳链球菌只在巴基斯坦发现。此外，无论是中国还是巴基斯坦，所有的无乳链球菌分离菌株均为PI-2b基因阳性，但PI-1和PI-2a基因均为阴性。所有的分离菌株都含有cfb、cylE、hylB和fbsB毒力基因，而大多分离菌株无bibA、rib和bca毒力基因。分离自中国的无乳链球菌均无bac和scp毒力基因，而分离自巴基斯坦的无乳链球菌均无cspA基因，同时两国的分离菌株中均未检测到spb1和lmb毒力基因。分离自巴基斯坦的无乳链球菌，尤其是血清Ia型菌株，与分离自中国的菌株相比，具有更高的生物被膜形成、溶血、细胞毒性、粘附和侵袭能力。大多数分离菌株对四环素、红霉素和克林霉素具有耐药性，而ermA、ermB、tetM和tetO等耐药基因的存在也从基因水平验证了分离菌株的耐药性。上述研究结果为由无乳链球菌引起的奶牛乳房炎特异性防治措施的制定具有重要指导意义。

抗生素耐药性已成为威胁人类健康的全球性问题。抗生素被广泛应用于肉鸡养殖从而影响它们的肠道微生物组和耐药组。为了更好地了解对农场动物持续性给药是如何改变微生物生态的变化，我们采用宏基因组的方法，研究脉冲式抗生素给药对肉鸡粪便微生物群、耐药基因（ARGs）及其宿主的影响。肉鸡分别接受三次连续五天的阿莫西林、金霉素、氟苯尼考单独给药和三种药的联合给药。结果显示，给药氟苯尼考能显著增加耐药基因floR和mcr-1的丰度，而给药阿莫西林则显著增加编码AcrAB-tolC外排泵的相关基因，如marA、soxS、sdiA、rob、evgS and phoP。这三种抗生素给药都显著增加微生物群中变形菌门的丰度。我们推测，耐药基因宿主埃希菌属丰度的上升，主要是由于在脉冲式抗生素给药下，其携带了β-内酰胺类、氯霉素和四环素耐药基因。这些结果表明，脉冲式阿莫西林、金霉素、氟苯尼考或三种药物的联合给药都能显著提高微生物群中变形菌门的丰度，而且会增加特定耐药基因的丰度。耐药基因大类主要由多重耐药基因组成，并且在抗生素处理的组别中，多重耐药基因的丰度与耐药基因总丰度具有很强的相关性。本研究对经脉冲式抗生素给药的鸡的粪便微生物群和耐药组的改变提供了全面的见解。

近年来，碳青霉烯耐药肠杆菌成为了一个威胁临床抗生素治疗的问题。肠杆菌属细菌作为腐生多宿主细菌，在环境、畜禽和人之间广泛存在，调查畜禽养殖生产过程中的碳青霉烯耐药肠杆菌属细菌，对预防和遏制肠杆菌属细菌碳青霉烯类耐药具有重要意义。

本研究从中国某养鸭场的鸭肠道与环境样本中，分离出携带bla_IMI的碳青霉烯类和黏菌素耐药肠杆菌属细菌。药敏试验显示，四株bla_IMI阳性肠杆菌属细菌分离株对碳青霉烯和黏菌素具有耐药性。PCR和Sanger测序证明了在不同ST型的菌株中检测到了三种bla_IMI亚型。全基因组测序证明bla_IMI基因存在于这些菌株的染色体或质粒中。接合转移实验证明了携带bla_IMI的质粒具有水平传播的能力。我们运用比较分析手段对其分子进化特征进行了研究，发现两株bla_IMI-16阳性阿氏肠杆菌之间具有高度相似的基因环境，但有着较远的亲缘关系，这提示了bla_IMI-16水平传播的可能。此外，携带bla_IMI-16的质粒是IncFⅠⅠ(Yp)质粒，该型质粒能够使宿主菌具备生长的竞争性优势。在该质粒上，bla_IMI-16的上下游鉴定出大量的可移动遗传元件（MGEs）序列，以IS1081、Tn903和ISE居多。本研究中的bla_IMI阳性肠杆菌属细菌中还携带有毒力基因，有助于增强菌株致病性。

综上所述，我们发现了在中国某鸭场内的肠杆菌属细菌中，bla_IMI由IncFⅠⅠ(Yp)质粒携带并促进其传播，从而导致了细菌碳青霉烯耐药性的传播。可移动遗传元件在水平传播中发挥着重要作用。对于bla_IMI基因的研究较少，此前，从未在中国大陆的养殖源细菌中发现，也未见有bla_IMI-16基因在中国大陆被鉴定的报道。我们的研究为不同亚型bla_IMI基因在中国的传播提供了证据，并为研究bla_IMI阳性耐药肠杆菌属细菌提供了参考数据。本研究强调：我们仍需要定期监测动物饲养过程中的bla_IMI阳性肠杆菌属细菌，以预防及遏制日益严重的碳青霉烯类药物耐药性传播的威胁。

结核病（Tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起的一种严重危害人类健康并对畜牧业造成巨大威胁的人畜共患传染病。近年来，TB在全球范围内流行更为广泛，根据2022年世界卫生组织（WHO）的报告，2022年共有987万人患TB，其中死亡128万人。同时，TB与HIV的混合感染以及多重耐药TB的出现，为TB的防控带来了新的挑战。因此，解析Mtb的致病机制迫在眉睫。

丝氨酸蛋白酶在细菌入侵宿主以及免疫调节过程中发挥重要作用，我们的研究发现Rv1043c蛋白是Mtb细胞壁相关的丝氨酸蛋白酶，1-18位氨基酸为其信号肽序列，在致病性分枝杆菌中高度保守。我们以Rv1043c蛋白为研究对象，开展了该蛋白的酶学特性及其在致病性中的研究。

首先通过原核表达和亲和层析纯化获得Rv1043c蛋白，酶活性测定结果显示Rv1043c能够切割Casein底物，其最适温度为45 ℃、最适pH值为9.0，且Ca²⁺ 和Mg²⁺能够促进其活性的发挥，279位丝氨酸（S）为蛋白酶的关键活性位点，表明Rv1043c蛋白酶为丝氨酸蛋白酶。圆二色分析结果显示，Rv1043c蛋白酶在温度10 ℃-70 ℃、pH3.0-pH4.0和pH7.0-pH10.0的范围内二级结构稳定，在pH5.0和pH6.0条件下Rv1043c蛋白二级结构稳定性发生改变。

为了研究Rv1043c在分枝杆菌感染中的作用，我们构建了重组耻垢分枝杆菌Msg_pAIN、Msg_Rv1043c和Msg_Rv1043c^S279A。亚细胞定位和免疫电镜分析显示，Rv1043c蛋白定位于Mtb的表面；重组菌Msg_pAIN、Msg_Rv1043c和Msg_Rv1043c^S279A感染小鼠腹腔巨噬细胞，经细胞毒性和凋亡分析显示，Rv1043c丝氨酸蛋白酶活性能够明显促进小鼠腹腔巨噬细胞的LDH释放；重组菌Msg_pAIN、Msg_Rv1043c和Msg_Rv1043c^S279A感染C57BL/6小鼠，经病理学、组织病理学、肺细胞凋亡、菌落定殖和炎性细胞因子分析显示，Rv1043c丝氨酸蛋白酶活性促进分枝杆菌在小鼠肺脏中的定殖，诱导肺细胞凋亡和肺的病理损伤，促进小鼠炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的释放。

以上研究结果表明Rv1043c丝氨酸蛋白酶在分枝杆菌致病过程中发挥重要作用，本研究为进一步解析Mtb的致病机制提供理论基础。

禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli ,APEC）是一种肠外致病性大肠杆菌（Extraintestinal pathogenic E. coli , ExPEC），可引起禽类和人类肠道以外组织的严重感染。MprA（microcin production regulation, locus A，现更名为AbsR，a blood survival regulator）是MarR（multiple antibiotic resistance regulator）转录调节因子家族的成员。它调控人源ExPEC中荚膜生物合成基因的表达，并且具有作为药物靶标的潜力。然而，目前的研究尚未完全阐明AbsR的靶基因及其调控机制。本研究利用ChIP-Seq和RNA-Seq技术对APEC AbsR调节子进行了系统分析，结果表明，AbsR直接调控99个基因，间接调控667个基因。接下来通过实时荧光定量PCR和体外实验证实了AbsR对靶基因转录水平和功能的影响。研究发现，AbsR在APEC XM中直接调控K1荚膜基因簇的表达，从而使菌株能够抵抗巨噬细胞的吞噬、血清杀伤，并发挥毒力作用。此外，AbsR还直接激活酸感应信号系统基因evgAS及耐酸相关基因hdeBAD和gadE，从而发挥体外耐酸能力。它还通过直接激活T2SS基因簇的表达，进而影响SslE蛋白的表达和分泌促进生物膜形成。此外，AbsR还间接调控I-F CRISPR系统基因的表达。在小鼠模型中，我们探索了AbsR及其靶基因对APEC XM毒力的影响，证实AbsR主要通过荚膜基因簇发挥毒力。在另外三株不同来源的ExPEC分离株中，AbsR可以抑制1型菌毛基因和I-F CRISPR系统相关基因的表达，同时激活酸感应信号系统基因evgAS、Group 2荚膜基因的表达；表明这些调控对于ExPEC共同的靶基因具有普适性。本研究首次系统梳理了MarR家族转录调控因子AbsR在肠道外致病性大肠杆菌的调控网络及其调控机制，明确了AbsR作为一类调控蛋白的调控方式及其致病机制。研究还首次证实AbsR对肠道外致病性大肠杆菌中的共同靶基因的调控具有普适性，这大大增进了我们对AbsR调控和功能的理解，并拓展了AbsR调控网络的广度。这对于预防及治疗大肠杆菌病的药物选择及维持宿主共生菌群稳态提供了重要参考。此外，该研究结果也为将来基于AbsR的药物筛选和研发提供理论依据。

膜囊泡（membrane vesicles，MVs）可以主动分泌到细菌细胞外环境中，参与细菌和宿主的相互作用。大多数革兰氏阴性菌可以通过释放脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)结合的外膜囊泡（out membrane vesicles，OMV），激活Caspase-11介导的非经典炎症通路，引起宿主细胞发生焦亡。然而，革兰氏阳性菌2型猪链球菌（Streptococcus suis serotype 2，S. suis 2）分泌的MVs引起细胞发生焦亡的机制尚不清楚。本研究利用超高速离心法、密度梯度离心、电子显微镜分析、蛋白质组学质谱鉴定、SDS-PAGE蛋白电泳和蛋白免疫印迹方法，分离、鉴定和表征MVs；利用荧光探针示踪分析、蛋白质印迹、荧光定量PCR和生物测定等方法，探究S. suis 2分泌的MVs与宿主的相互关系。研究结果显示，分离并鉴定S. suis 2来源的MVs大小范围在50 nm到400 nm之间，平均直径为72.04 nm，具有膜结构。蛋白质组学质谱鉴定表明，MVs携带200种细菌蛋白质，其中包含6个已知的S. suis 2的毒力蛋白。MVs主要通过动力蛋白依赖的内吞作用被转运到内皮细胞中，并激活内皮细胞中的NLRP3/Caspase-1/GSDMD经典炎症小体信号通路，产生活化的Caspase-1并切割GSDMD，形成焦亡的执行者—GSDMD-N，诱导细胞发生焦亡，向细胞外释放活化的IL-1β和LDH，但MVs不激活内皮细胞的Caspase-4/-5非经典通路。此外，内皮细胞在S. suis 2来源的MVs的诱导下产生大量活性氧（ROS）并导致线粒体失去膜电位引起线粒体DNA（mtDNA）向胞质释放，胞质中ROS和mtDNA的累积可能是激活NLRP3炎性小体的原因。本研究揭示了S. suis 2分泌的MVs通过动力蛋白依赖性内吞作用被内皮细胞内化，并可能通过损伤细胞线粒体诱导mtDNA、ROS的产生和释放，从而激活细胞NLRP3/Caspase-1/GSDMD经典通路，诱导内皮细胞发生焦亡。本研究首次揭示了S. suis 2通过分泌MVs激活内皮细胞NLRP3/Caspase-1/GSDMD经典通路，诱导内皮细胞发生焦亡的作用机制。

恶唑烷酮类抗生素作为目前治疗多重耐药革兰氏阳性菌感染最有效的抗生素之一，其耐药基因optrA的流行和传播备受关注，然而，目前optrA基因在链球菌中的流行情况尚不十分清楚。本文从山东省某猪场分离出一株多发性链球菌（Streptococcus pluranimalium， S. pluranimalium）SP28，通过肉汤稀释法测定了该分离株的药物敏感性，其次利用Illumina和Nanopore测序技术测定了该分离株的全基因组序列，通过生物信息学技术对全基因组序列进行比对分析，最后利用PCR方法检测插入序列IS1216E介导的易位单元（Translocatable Unit， TU）。研究结果显示，分离株SP28表现出多重耐药表型和相对高的利奈唑胺MIC值。全基因组测序结果表明，成功获得了该分离株的完整染色体序列和一个质粒序列。耐药基因检测分析发现，该分离株的染色体携带optrA基因以及多个介导其它类型抗生素的耐药基因。耐药基因环境分析显示optrA和fexA所在的耐药区域侧翼为两个同向的IS1216E插入序列，PCR检测结果显示携带optrA的耐药区域能够利用TU的方式进行水平转移，进而导致optrA的广泛传播。本研究首次在S. pluranimalium中发现耐药基因optrA，同时进一步揭示了IS1216E在optrA基因转移中发挥的重要作用。

本研究从中国鸭中分离出一株高致病性且多重耐药的多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，PM）HN141014。基于HN141014的全基因组生物信息学分析及共轭转移试验，鉴定出一种新型的多重耐药整合接合元件（ICEPmu3）。该元件属于ICEHin1056亚家族，具有种内种间转移特性，包含除tfc1和tfc20外几乎完整的Ⅳ型分泌系统，携带tetR(B)-tet(B)-tetC、aph(3ʹ)-Ia和sul2-strA-strB等多种耐药基因。进一步分析发现，ICEPmu3还存在于亚洲和美洲源的其他3株PM和8株禽类芽孢杆菌中。这些结果表明ICEPmu3的出现和流行可能会加剧养禽业中PM的防控难度。