非洲猪瘟（African Swine Fever，ASF）给我国养猪业造成巨大的经济损失。由于没有安全有效的疫苗，所以快速准确的诊断对ASF有效防控至关重要。间接免疫荧光法（Indirect Immunofluorescence Assay，IFA）是世界动物卫生组织（World Organization for Animal Health，WOAH）推荐的一种ASF血清学检测的金标准方法。

在本研究中，我们制备了野猪肾细胞（BK2258），该细胞能够支持非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）SD/DY-I/21株高效复制，并表现出明显的细胞病变效应。利用BK2258建立了一种用于ASFV抗体检测的IFA方法。我们使用接种低毒力基因I型SD/DY-I/21株、基因II型HLJ/HRB1/20株和候选疫苗HLJ/18-7GD株免疫猪只的血清样品，同时也使用现地血清样品和阴性血清样品对该方法的特性进行了评估。利用IFA检测ASFV阳性血清，显示出明亮且特异的绿色荧光灶，没有因细胞衰老或其他细胞损伤因素引起的非特异性绿色荧光。与商业化的间接酶联免疫吸附方法（indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，iELISA）相比，检测病毒不同感染时间的血清发现，IFA可提前1-4天检测到ASFV抗体。IFA和iELISA对同一份ASFV抗体阳性血清样本的检出限分别为1:25600和1:6400，表明IFA比iELISA更敏感。新建立的IFA检测方法具有高度特异性，与其他6种重要猪病原体，包括经典猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）、猪圆环病毒2型（Porcme Circovirus Type 2，PCV2）、伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus，PRV）、口蹄疫病毒O型（Foot-and-Mouth Disease Virus Type O，FMDV/O）和猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）的阳性血清无交叉反应。该研究提供了一种灵敏、特异且可靠的ASF血清学检测的金标准方法。

伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）引起的猪的一种急性传染病，给养猪业造成严重的经济损失。基因缺失活疫苗的广泛使用有效控制了该病的大范围暴发。尤其是gE基因缺失活疫苗配合其血清学鉴别诊断方法区分疫苗免疫和野毒株感染，为该病在猪群中的净化提供了技术支撑。目前，已有多种以gE蛋白为包被抗原的PRV抗体检测的ELISA方法被应用于野毒感染的筛查。然而，该类ELISA试剂盒大多基于传统抗体研发，其生产工艺复杂，成本高。纳米抗体具有抗原结合力强、耐极端环境、易基因工程改造和体外生产成本低等优点，已广泛用于疫病诊断技术的研发，具有巨大的市场应用前景。然而，目前还没有关于纳米抗体在PRV诊断与治疗中应用的研究报道。本研究用gE重组蛋白免疫双峰驼，并利用噬菌体展示文库筛选出了2株抗gE重组蛋白的特异性纳米抗体。随后，将纳米抗体与辣根过氧化物酶（HRP）融合表达，建立了基于纳米抗体-HRP猪血清PRV-gE抗体阻断ELISA（bELISA）方法。确定以PRV-Nb36-HRP为检测探针建立PRV-gE抗体bELISA，其条件为抗原包被量为每孔200 ng，Nb36-HRP和待检猪血清的稀释度分别为1：320和1：5。bELISA方法的临界值为24.20%，敏感性和特异性分别为96.43%和92.63%。与商品化IDEXX ELISA试剂盒的符合率为93.99%。此外，通过表位分析发现PRV-gE-Nb36识别的构象表位在不同PRV参考株中高度保守。本研究建立了一种基于纳米抗体的操作简单、稳定性高、重复性好、成本低的PRV-gE抗体bELISA检测方法，为PR的监测和净化提供创新型诊断试剂。本研究首次以纳米抗体融合HRP作为检测探针建立PRV-gE抗体bELISA检测方法，无需酶标二抗的使用，简化了生产工艺，节约了生产成本。

冠状病毒具有广泛的宿主范围，可以在人和动物之间传播，并引起不同严重程度的疾病。猪肠道甲型冠状病毒(Porcine enteric alphacoronavirus, PEAV) 于2017年首次在中国广东被报道，它是近几年新发现的猪肠道致病性冠状病毒，可导致新生仔猪发生水样腹泻。由于对PEAV的宿主免疫应答、炎症反应和致病机制尚无深入研究的报道，因此急需对PEAV的感染与复制机制进行探究。本研究通过对PEAV感染宿主细胞的转录组学进行分析，发现PEAV可以上调宿主的脂质代谢途径。在脂质代谢、能量稳态等过程中，脂滴(lipid droplets, LD)是具有主要功能的细胞器，同时LD在病毒感染和炎症反应中具有重要作用。在本研究中，我们探究了LD的积聚对宿主炎症反应以及PEAV复制的影响。在受感染的细胞中发现，PEAV增加LD的积聚，并可以上调NF-κB信号通路、促进炎症因子IL-1β和IL-8的产生以及诱导细胞死亡。通过使用DGAT-1 inhibitor抑制LD的积聚可显著抑制PEAV的复制、下调NF-κB信号通路、减少促炎因子IL-1β和IL-8的产生以及抑制细胞死亡。同时研究发现，使用NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082可显著抑制LD的积聚与PEAV的复制。盐酸二甲双胍(metformin hydrochloride)药物同样具有抗PEAV的效力，其可显著抑制LD的积聚、下调NF-κB信号通路、减少促炎因子IL-1β和IL-8的产生以及抑制细胞死亡。总之，我们证明了脂质代谢途径中LD的积聚在 PEAV复制和发病机制中的重要作用，同时探究了metformin hydrochloride通过抑制LD的积聚和炎症应答发挥抗PEAV的作用和减少病理损伤，为PEAV的治疗策略开辟了新的思路。

禽传染性支气管炎（IB）是由传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病。IBV在世界范围内流行，给养禽业造成了严重的经济损失。目前，许多商业化的IBV疫苗株（包括H120、M41、LDT3-A等）已广泛用于预防和控制禽传染性支气管炎，但由于IBV易于变异及重组导致疫苗免疫效果不够理想，IB疫情时有发生。

本研究从中国中部地区免疫过H120疫苗的鸡群中分离到两株IBV新毒株，分别命名为SX/2106和SX/2204，并对两株IBV的全基因组进行了序列测定及重组分析。基于S1基因的遗传演化分析结果显示，SX/2106属于GI-19基因型，SX/2204则属于GVI-1基因型。重组分析表明，SX/2106可能来源于GI-19基因型毒株、GI-7基因型毒株与类LDT3-A疫苗株的重组事件；SX/2204可能来源于GVI-13基因型毒株、GVI-1基因型毒株与类H120疫苗株的重组事件。病毒交叉中和试验表明，SX/2106及SX/2204的抗原性与H120疫苗株存在显著差异。动物实验表明，SX/2106和SX/2204均能在鸡的肺脏和肾脏中有效复制并引起发病和死亡；通过观察感染鸡后气管上皮细胞的纤毛运动情况，发现SX/2106和SX/2204感染均能显著抑制纤毛活性，对气管上皮细胞黏膜造成严重损伤。病毒交叉中和试验及免疫后攻毒保护试验结果表明，H120疫苗免疫并不能对这两株IBV感染提供有效保护。值得注意的是，与之前分离的GVI-1毒株相比，SX/2204的致病性有增强趋势，感染雏鸡死亡率高达60%，对于GVI-1基因型IBV毒株的监测与防控需引起高度重视。

IBV在自然界中通过重组和突变不断进化，产生新的变异株。目前鸡传染性支气管炎在我国鸡群中发病率居高不下，严重影响鸡产业的健康发展，持续加强IBV的流行病学监测及时发现新的变异毒株，对于预防和控制IBV流行具有重要意义。

禽偏肺病毒 (Avian metapneumovirus, aMPV)是一种高度传染性的病原体，可引起鸡和火鸡的急性上呼吸道疾病，造成严重的经济损失。目前，B亚型aMPV已成为中国鸡群中主要的优势流行毒株。本研究将B亚型aMPV LN16株在Vero细胞上进行连续传代，传至第30代时，成功获得了一株弱毒候选疫苗株，命名为LN16-A株。将LN16-A以2 × 10⁴ TCID₅₀/只的剂量接种SPF鸡后，接种鸡均未出现任何临床症状和病理损伤，表明LN16-A株已完全致弱，具备良好的安全性。为进一步评价LN16-A是否存在毒力返强风险，将LN16-A株在SPF鸡体内连续进行5次传代，观察每代鸡的临床症状并进行病理组织学检查和病毒载量检测，结果表明，不同传代的鸡均没有出现任何临床症状和病理损伤。此外，随着LN16-A株在鸡体内传代次数的增加，鼻甲骨中的病毒载量逐渐减少，传至第5代时，所有SPF鸡的鼻甲骨中病毒载量均为零。全基因组测序和分析结果表明，与野生型LN16（wtLN16）株的全基因组序列相比，LN16-A株的全基因组序列有9个氨基酸位点的突变，这些突变分别出现在N, P, F, SH, G和L基因上，表明这些基因可能与病毒的毒力有关。为进一步评价LN16-A株对SPF鸡的免疫保护效果，将LN16-A株以800 TCID₅₀/只的剂量免疫SPF鸡，免疫3周后进行攻毒。结果显示，LN16-A株免疫后可以诱导机体产生较高水平的中和抗体，上调CD4+T淋巴细胞亚群的比例并促进Th1（IFN-γ）和Th2（IL-4和IL-6）细胞因子的表达，这表明LN16-A株可以诱导机体产生强烈的体液免疫和细胞免疫。此外，攻毒保护试验结果表明，LN16-A株可对B亚型aMPV强毒攻击提供100%的免疫保护效果，并显著降低攻毒后的排毒水平和鼻甲骨炎症。这些结果表明，LN16-A是一株安全性好、具有良好免疫原性的弱毒活疫苗候选株，可以有效预防B亚型aMPV对鸡的感染。本研究首次以B亚型aMPV鸡源分离株LN16为研究对象，利用传代方法将其成功致弱，系统评价了其作为弱毒疫苗株的安全性和有效性，并分析了可能与病毒毒力有关的关键氨基酸位点，研究结果为进一步研究aMPV的致病机制和安全有效的新型疫苗奠定了基础。

H10亚型禽流感病毒（AIV）在中国流行的40余年间感染宿主从野生鸟类扩大到家禽和哺乳动物。近年，H10亚型AIV在中国南方多省造成人感染事件。辽宁省位于中国东北部，该省以前少有H10亚型禽流感病毒的相关研究。本研究在AIV主动监测工作中，自辽宁省活禽市场分离到一株H10N3型禽流感病毒，命名为A/chicken/Liaoning/SY1080/2021(SY1080)。SY1080可在小鼠肺脏和鼻甲内复制，对小鼠呈低致病性。本研究将SY1080与国内已公布的256株H10亚型AIV一同进行遗传进化、宿主多样性、分子特征等分析，系统解析H10Nx亚型AIV在中国的遗传进化规律。进化分析表明，包括SY1080毒株在内的250株H10亚型AIV属于欧亚谱系，只有7株H10亚型AIV属于北美谱系。我国分离的H10亚型AIV可划分为63种基因型，SY1080与H10N3亚型AIV人源分离株，均属于G60基因型。H10亚型AIV在流行过程中获得多个哺乳动物适应性和毒力增强的相关位点突变，并且与H9N2亚型AIV重组，产生内部基因以H9N2亚型AIV为主的H10亚型重组病毒。本研究总结了H10Nx病毒在我国遗传进化规律和主要生物学特性，研究结果提示该亚型病毒具有潜在公共卫生风险，应加强对H10亚型毒株的监测。

近年来，越来越多的自然感染病例报道及动物攻毒实验证实猫科动物可以感染多种亚型的A型流感病毒。值得注意的是，某些亚型A型流感病毒在跨物种传播后可以在猫科动物中长期流行，甚至可以感染人类。这对公共卫生安全造成了潜在威胁。与A型流感病毒聚合酶活性相互作用的宿主因子是决定其感染宿主范围的关键因素，而ANP32蛋白是其中重要的一个宿主因子。但是，猫源ANP32蛋白对A型流感病毒聚合酶活性的调控作用及其对病毒感染宿主范围的潜在影响仍属未知领域。在本研究中，利用RT-PCR方法从家猫组织中共克隆了10个猫源ANP32剪接变异体，其中分别包括5个ANP32A、3个ANP32B及2个ANP32E变异体。测序及蛋白序列比对的结果表明部分猫源ANP32剪接变异体发生了氨基酸的缺失及/或插入。激光共聚焦实验的研究结果表明所有10个猫源ANP32剪接变异体都主要定位于细胞核。在本研究中，还建立了多个A型流感病毒代表性毒株的小基因组复制系统。利用该系统，评估了猫源ANP32蛋白对A型流感病毒聚合酶活性的调控作用。研究结果表明大部分猫源ANP32A及ANP32B蛋白都可以支持所检测的A型流感病毒的聚合酶活性，但是同一种ANP32蛋白对不同A型流感病毒毒株聚合酶活性的支持作用有所差别。此外，体外研究的结果证实了猫源ANP32蛋白可以支持H3N2犬流感病毒在细胞中复制。综上所述，本研究系统分析了猫源ANP32A蛋白对A型流感病毒聚合酶活性的调控作用，为研究猫科动物对A型流感病毒易感的分子机制提供了基础。

【背景】H7N9亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）是家禽养殖业的重大威胁。基于新城疫病毒载体的H7N9亚型禽流感疫苗（NDV_vecH7N9）的保护效力高，且可通过群体免疫方式（如喷雾、饮水等）进行投放，为提高H7N9亚型禽流感的防控效率提供了有效措施。NDV_vecH7N9疫苗不能诱导鸡产生H7N9特异性的血凝抑制（Hemagglutination-inhibition, HI）抗体，却可以诱导高水平的IgG抗体。但是，NDV_vecH7N9疫苗抗体应答的分子基础和抗体保护机制尚不清楚。【目的】解析NDV_vecH7N9疫苗抗体免疫的分子基础与抗体的免疫保护机制。【方法】制备NDV_vecH7N9疫苗免疫鸡血清并测定血清的HI、病毒中和（Virus neutralization, VN）与IgG抗体滴度；基于被动免疫模型评价NDV_vecH7N9免疫血清对H7N9亚型AIV的保护力；利用竞争酶联免疫吸附试验鉴定NDV_vecH7N9免疫血清识别的优势抗原表位；基于建立的抗体依赖的补体介导的细胞毒试验与补体介导的病毒中和试验，评价NDV_vecH7N9免疫血清诱导的补体应答。【结果】NDV_vecH7N9疫苗诱导鸡产生较低的HI、VN抗体与较高的血凝素（Hemagglutinin, HA）特异性IgG抗体。经被动免疫方式接种NDV_vecH7N9免疫血清可对鸡提供针对H7N9病毒攻击的完全保护。位于HA蛋白抗原位点A区的S150、G151与 S152位点是NDV_vecH7N9免疫血清识别的优势抗原表位。此外，NDV_vecH7N9免疫血清能够介导表达HA蛋白的细胞或H7N9病毒感染细胞的裂解，并显著抑制H7N9病毒的感染性。加热灭活或补体抑制剂处理显著降低血清介导的细胞裂解与病毒中和效应，说明补体发挥了重要作用。将HA蛋白S150、G151与 S152位点突变后，NDV_vecH7N9免疫血清介导突变病毒感染细胞的裂解与对突变病毒的中和活性均显著下降，说明血清抗体与抗原的结合对于补体活性是必须的。【结论】NDV_vecH7N9疫苗诱导的抗体能够激活补体系统，介导对H7N9病毒感染细胞的细胞毒作用，以及对H7N9亚型AIV的中和作用。【创新性】研究结果揭示了补体系统激活是NDV_vecH7N9疫苗抗体免疫的重要机制，提示激活补体系统对H7N9亚型禽流感疫苗的设计具有潜在意义。

嵴病毒（Kobuvirus, KoV）是微RNA病毒科的一个新的属，包括A型爱知病毒-F型爱知病毒（Aichivirus A-F）6个种，目前只在牛和绵羊中检测到Aichivirus D。我们在采用宏基因组技术鉴定某爆发腹泻的山羊场的腹泻病原时，意外的在粪便中发现了Aichivirus D序列，本实验的目的是研究山羊源Aichivirus D的分子特征并调查其与山羊腹泻的联系。根据病毒宏基因组学技术获得的Aichivirus D部分序列设计引物，成功地从腹泻样本获得了一个近乎全长Aichivirus D基因组（8,461 bp），包含7,524 bp 的完整编码框，与绵羊Aichivirus D的遗传关系最近，可能由绵羊Aichivirus D通过重组进化而来，重组区域位于VP1基因。为进一步调查Aichivirus D与山羊腹泻的联系，从3个爆发腹泻的羊场采集了116份2-60日龄的羔羊粪便样本（61份腹泻样本，55份临床健康粪便样本），采用特异性RT-PCR进行了Aichivirus D的检测。结果表明，腹泻样本中Aichivirus D阳性率为55.74% (34/61)，显著高于健康样本(14.55%，P＜0.001)，且其它常见腹泻病原未检出，提示Aichivirus D与山羊腹泻有关。在此基础上，又从9个阳性样本中扩增出完整的VP0、VP3和VP1基因，与绵羊源Aichivirus D相比，山羊源Aichivirus D的VP0、VP3和VP1基因有独特的氨基酸突变和遗传进化特征。总之，本实验首次证明Aichivirus D感染山羊，且该病毒可能与山羊腹泻有关。该病毒与绵羊Aichivirus D的亲缘关系最为密切，可能是由绵羊AichiVirus D 重组进化而来的。这些结果有助于深入了解Aichivirus D的宿主范围和遗传进化。

The stamping-out strategy has been used to control highly pathogenic avian influenza viruses in many countries, driven by the belief that vaccination would not be successful against such viruses and fears that avian influenza virus in vaccinated birds would evolve more rapidly and pose a greater risk to humans.  In this review, we summarize the successes in controlling highly pathogenic avian influenza in China and make suggestions regarding the requirements for vaccine selection and effectiveness.  In addition, we present evidence that vaccination of poultry not only eliminates human infection with avian influenza virus, but also significantly reduces and abolishes some harmful characteristics of avian influenza virus.

非洲马瘟（AHS）是一种由非洲马瘟病毒（AHSV）引起的马属动物急性和亚急性虫媒传染病。该病在中国被列为一类动物传染病。中国是AHS无疫区，2020年在邻国泰国和马来西亚相继爆发AHS，增加了该病传入中国的风险。因此，开发快速准确的 AHSV 诊断方法对于监测和预防AHS在中国的发生至关重要。本研究以AHSV 基因组中高度保守的vp7 mRNA为检测靶标，开发了一种反转录重组酶介导等温核酸扩增技术（RT-RAA）联合CRISPR/Cas12a系统（CRISPR/Cas12a-RT-RAA）的方法检测AHSV，并对该方法的性能进行了评估。结果显示，其最低检测限是10 个拷贝vp7 mRNA/反应，检测敏感性是RT-qPCR的10倍；该方法与马传染性贫血病毒、马动脉炎病毒、马流感病毒、马疱疹病毒1型/4型、马链球菌和马沙门氏菌等其他马病原体核酸没有交叉反应。此外，该方法检测结果读取方便快捷，在紫外光下肉眼可以直接观察，无需特殊仪器。由于缺乏 AHSV 阳性的临床样本，我们通过在马血液和组织 mRNA 中添加 vp7 mRNA 作为对照，证实了该检测方法在临床实践中的适用性。总之，本研究建立的RT-RAA-CRISPR/Cas12a方法在AHSV 检测中具有便捷、灵敏度高和特异性好的优势，可能有助于AHS 的早期预警和诊断。