中国农业科学 ›› 2024, Vol. 57 ›› Issue (3): 454-468.doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2024.03.003
收稿日期:
2023-07-05
接受日期:
2023-08-11
出版日期:
2024-02-01
发布日期:
2024-02-05
通信作者:
联系方式:
韩立杰,E-mail:hanlijie@hebnetu.edu.cn。
基金资助:
Received:
2023-07-05
Accepted:
2023-08-11
Published:
2024-02-01
Online:
2024-02-05
摘要:
高粱是世界第五大粮食作物,可作为食用、饲用、酿造用和生物能源用。高粱遗传转化技术是高粱功能基因组学研究中必不可少的重要工具,同时,也可作为传统育种方法的重要补充。本文对近年来高粱遗传转化的研究进展进行总结,分析高粱遗传转化中存在的难题,并提出进一步的解决策略,以期为高粱遗传转化技术的进一步改良提供参考。通过对近年来50余篇高粱组织培养和遗传转化文献进行归纳总结。介绍用于遗传转化的高粱基因型、外植体来源、再生体系构建等方面的研究现状,对比电穿孔法、花粉管通道法、基因枪法和农杆菌介导法4种高粱遗传转化常用方法的优劣,总结遗传转化载体主要组成部分启动子、目的基因、选择标记基因和报告基因对转化效率的影响,阐述高粱遗传转化的应用现状,分析高粱遗传转化技术存在的主要瓶颈问题,研究对策措施。高粱基因型对组织培养有很大影响,以P898012和Tx430最为常用。基因枪法和农杆菌介导法是最常用的高粱遗传转化方法,且农杆菌介导法的优势逐渐显现。在载体构建中,CaMV35S启动子和ubi1启动子最为常用,抗生素抗性基因(nptII、hpt)、除草剂抗性基因(bar)和养分同化基因为常用的三大类选择标记基因。随着高粱遗传转化技术及CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术的不断发展,一些重要农艺性状基因被成功转入高粱。但基因型依赖性强、组织培养周期长、遗传转化稳定性差是限制高粱遗传转化的主要瓶颈,通过引入形态发生调节因子,直接进行体细胞发生,缩短了组织培养周期,提高了转化效率,扩大了外植体来源,高粱遗传转化技术取得重大突破。通过引入形态发生调节因子,采用切-浸-芽(CDB)递送系统等方式可进一步改良高粱遗传转化技术,结合CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用,必将为高粱分子育种及相关基因功能鉴定提供重要的技术支撑。
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表1
高粱遗传转化研究进展"
转化方法 Transformation method | 基因型 Genotype | 外植体 Explant | 载体 Vector | 选择标记 Selectable marker | 启动子 Promoter | 筛选剂及筛选压 Screening agent and screening pressure | 报告基因 Report gene | 转基因检测 Transgenic detection | 转化效率 Transformation efficiency (%) | 参考文献 References |
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电穿孔法 Electroporation | - | 原生质体 Protoplast | p35SCAT/ pCopa-CAT | - | CaMV35S copia promoter of Drosophila | 氯霉素 Chloramphenicol | - | Scintillation counting | - | [ |
电穿孔法 Electroporation | NK300 | 原生质体 Protoplast | pBI221.1 | nptⅡ | CaMV35S | 100 mg·L-1卡那霉素 Kanamycin | GUS | Gel blot hybridization | - | [ |
电穿孔法 Electroporation | Sorghum vulgare (cv Grazer) | 细胞悬浮液 Cell suspension | pBC1/pNGI | nptⅡ/hpt | adh1/CaMV35S | 500 mg·L-1卡那霉素Kanamycin/50 mg·L-1 潮霉素Hygromycin | GUS | GUS assay/ Gel blot hybridization | - | [ |
花粉管通道法 Pollen-mediated transformation | TX622B | 花柱 Style | - | nptⅡ | - | 100 mg·L-1卡那霉素 Kanamycin | - | 丝黑穗病鉴定/聚丙烯酰氨凝胶电泳 Head smut disease detection/ polyacrylamide gel electrophoresis | 6.80 | [ |
花粉管通道法 Pollen-mediated transformation | A(2)V4A/A(2)V4B | 花粉 Pollen | pBI121 | nptⅡ | CaMV35S | 卡那霉素 Kanamycin | GUS | PCR/Southern blot | - | [ |
基因枪法 Particle bombardment | P898012 | 幼胚 Immature embryo | pPHP620/ pPHP687 | bar | CaMV35S | 3 mg·L-1 bialophos | GUS | Southern blot/GUS assay | 0.29 | [ |
基因枪法 Particle bombardment | SRN39 | 幼穗 Immature infloresences | pPHP620 | bar | CaMV35S | 3 mg·L-1 bialophos | GUS | Southern blot/GUS assay | 2.61 | [ |
基因枪法 Particle bombardment | Tx430 | 幼胚 Immature embryo | - | bar | CaMV35S | 1-2 mg·L-1 basta | - | Southern blot/Western blot/ PCR | 0.09 | [ |
基因枪法 Particle bombardment | M35-1/SA281/QL41/P898012 | 幼胚 Immature embryo | pAHC20 | bar | ubi1/act1/ CaMV35S | 2 mg·L-1 bialophos | GFP | Southern blot/荧光显微镜 Southern blot/Fluorescence microscope | 1.00 | [ |
基因枪法 Particle bombardment | RTx430 | 幼胚 Immature embryo | pAHC20/ pAct1-D | bar | ubi1/act1 | 5 mg·L-1 PPT | GUS | Southern blot/GUS assay | 0.18 | [ |
基因枪法 Particle bombardment | Tx430/C401/ CO25 | 幼胚 Immature embryo | pPZP200/ pUC18 | hpt | ubi1/CaMV35S/HBT/act1/adh1 | - | GUS/GFP | 荧光显微镜/GUS assay Fluorescence microscope/ GUS assay | - | [ |
基因枪法 Particle bombardment | 恢复系 Restorer line 5-27/115 | 幼穗 Immature infloresences | pKUB | hpt | - | 20 mg·L-1潮霉素 Hygromycin | GUS | PCR/Southern blot/ GUS assay | - | [ |
基因枪法 Particle bombardment | 214856 | 幼胚/芽尖 Immature embryo/Shoot tip | pAct1-D/ pAHC25 | nptⅡ | ubi1/adh1/act1D/ CaMV35S | 25-100 mg·L-1遗传霉素Geneticin | GUS | PCR/Southern blot/ GUS assay | 1.30 | [ |
基因枪法 Particle bombardment | BTx623 | 芽尖 Shoot tip | pJS108/ pmpiC1cry1Ac | bar | mpiC1 | 1-2.05 mg·L-1 basta | GUS | PCR/Southern blot/ GUS assay | 1.50 | [ |
基因枪法 Particle bombardment | 32个品种 Varieties | 幼胚 Immature embryo | pPH1687 | hpt | ubi1 | 40 mg·L-1潮霉素 Hygromycin | LUC | Southern blot/荧光素酶测定 Southern blot/Luciferase camera assay | 0.09 | [ |
基因枪法 Particle bombardment | P898012 | 幼胚 Immature embryo | pAHC25/ pNOV3604 | bar/pmi | ubi1 | 9 g·L-1甘露糖 Mannose+12 g·L-1 麦芽糖Maltose | GUS | PCR/Southern blot | 0.77 | [ |
基因枪法 Particle bombardment | Tx430 | 幼胚 Immature embryo | pUKN/pGEM-Ubi-gfp | nptⅡ | ubi1 | 30 mg·L-1遗传霉素 Geneticin(G418) | GFP | PCR/Southern blot/荧光显微镜 PCR/Southern blot/ Fluorescence microscope | 20.70 | [ |
基因枪法 Particle bombardment | Hiro1 | 成熟胚 Mature embryo | pCAMBIA1301/p35S::SbGW2-GFP | hpt | ubi/CaMV35S | 10 mg·L-1 潮霉素 Hygromycin | GFP | PCR/荧光显微镜 PCR/Fluorescence microscope | 12.31 | [ |
基因枪法 Particle bombardment | Tx430 | 幼胚 Immature embryo | pBSV003 | nptⅡ | ubi1 | 25-35 mg·L-1遗传霉素 Geneticin(G418) | GUS | PCR/GUS assay | 27.20-46.60 | [ |
基因枪法 Particle bombardment | IS4698 | 成熟胚 Mature embryo | pMD18T-UBI-NPTII/pMD18T-UBI-GUS | nptⅡ | ubi1 | 30 mg·L-1遗传霉素 Geneticin(G418) | GUS | PCR/GUS assay | 13.33 | [ |
农杆菌介导法 Agrobacterium-mediated transformation LBA4404 | P898012/ PHI391 | 幼胚 Immature embryo | pSB1/pSB11 | bar | ubi1 | 5 mg·L-1 PPT | GUS | Southern blot | 2.10 | [ |
农杆菌介导法 Agrobacterium-mediated transformation EHA105/EHA101/AGL1 | Tx430/C401/ Wheatland | 幼胚/叶子 Immature embryo/Leaf | pPZP200/ pUC18 | - | ubi1/CaMV35S/ HBT/act1/adh1 | - | GUS/GFP | 荧光显微镜/GUS assay Fluorescence microscope/ GUS assay | - | [ |
农杆菌介导法 Agrobacterium-mediated transformation LBA4404 | P898012 | 幼胚 Immature embryo | pTOK233 | hpt | CaMV35S | 15 mg·L-1潮霉素 Hygromycin | GUS | Southern blot/GUS assay | 0.80-3.50 | [ |
农杆菌介导法 Agrobacterium-mediated transformation EHA101 | C401/ Pioneer8505 | 幼胚 Immature embryo | pPZP201 | pmi | ubi1 | 1%-2%甘露糖 Mannose | GFP | Southern blot/Western blot/荧光显微镜 Southern blot/Western blot/ Fluorescence microscope | 2.88-3.30 | [ |
农杆菌介导法 Agrobacterium-mediated transformation EHA101 | Tx430/C401/ Pioneer8505 | 幼胚 Immature embryo | pPZP201 | - | ubi1 | - | GFP | Southern blot/Western blot/荧光显微镜 Southern blot/Western blot/ Fluorescence microscope | 1.00-3.00 | [ |
农杆菌介导法 Agrobacterium-mediated transformation NTL4 | Tx430/C2-97 | 幼胚 Immature embryo | pPTN290 | nptⅡ | ubi1 | 10 mg·L-1遗传霉素 Geneticin/20 mg·L-1 巴龙霉素Paromomycin | GUS | Southern blot/GUS assay | 0.30-4.50 | [ |
农杆菌介导法 Agrobacterium-mediated transformation LBA4404 | Sensako 85/ 1191 | 幼胚 Immature embryo | pCAMBIA1301 | hpt | CaMV35S | 5 mg·L-1潮霉素 Hygromycin | GUS | Southern blot/GUS assay | 5.00 | [ |
农杆菌介导法 Agrobacterium-mediated transformation EHA101/LBA4404 | P898012/Tx430/296B/C401 | 幼胚 Immature embryo | pPZP201 | pmi | ubi1 | 1%-2%甘露糖 Mannose | GFP | PCR/Western blot/荧光显微镜 PCR/Western blot/ Fluorescence microscope | 8.30 | [ |
农杆菌介导法 Agrobacterium-mediated transformation EHA105 | 恢复系 Restorer line 115/5-27/9198/R011 保持系 Maintainer line ICS21B/21B | 幼穗 Immature infloresences | pKUB | hpt | CaMV35S/ ubi1 | 50 mg·L-1潮霉素 Hygromycin | GUS | RT-PCR/Southern blot/ Western blot | 1.90 | [ |
农杆菌介导法 Agrobacterium-mediated transformation EHA101 | P898012 | 幼胚 Immature embryo | pZY102/pZY101 -TC2/pZY101-SKRS | bar | CaMV35S/ CZ19B1 | 2.5 mg·L-1草铵膦 Glufosinate-ammonium | - | PCR/Southern blot | 0.40-0.70 | [ |
农杆菌介导法 Agrobacterium-mediated transformation LBA4404/EHA105 | CO25/ TNS586 | 幼胚 Immature embryo | pMKURF2/ pCAMBIAG11/ pCAMBIARC7 | bar/hpt | ubi1 | 1-2 mg·L-1 bialophos/ 10-25 mg·L-1潮霉素 Hygromycin | GUS | Western blot | 1.60-2.70 | [ |
农杆菌介导法 Agrobacterium-mediated transformation LBA4404 | M 35-1 | 成熟胚/幼苗/叶基/幼穗 Mature embryo/Young seedling/Leaf base/ Immature infloresences | pKU352NA | hpt | ubi1 | 20 mg·L-1潮霉素 Hygromycin | SGFPS65T | Inverse PCR | 4.28 | [ |
农杆菌介导法 Agrobacterium-mediated transformation NTL4 | P898012/ RTX430 | 幼胚 Immature embryo | pCAMBIA1305.2/pCAM-Ubi-gus | hpt | ubi1 | 20 mg·L-1潮霉素 Hygromycin | GUS | PCR/Southern blot | 2.40 | [ |
农杆菌介导法 Agrobacterium-mediated transformation LBA4404 | APK1 | 芽尖 Shoot tip | pCAMBIA1305.1 | hpt | CaMV35S | 5 mg·L-1潮霉素 Hygromycin | GUS | PCR/Southern blot | 1.20-3.90 | [ |
农杆菌介导法 Agrobacterium-mediated transformation LBA4404/AGL1 | TX430 | 幼胚 Immature embryo | pSB1/pSB11 | moPAT/ pmi | ubi1 | 5-10 mg·L-1 PPT/ 12.5 g·L-1 甘露糖Mannose | DSRED | qPCR | 10.00-33.00 | [ |
农杆菌介导法 Agrobacterium-mediated transformation AGL1/EHA101/GV3101 | P898012 | 幼胚 Immature embryo | pZY102/ pFGC5941/ pFGC161 | bar | MAS/ubi1/ CaMV35S | 2.5 mg·L-1草铵膦 Glufosinate-ammonium | GUS | PCR/Southern blot | 14.00 | [ |
农杆菌介导法 Agrobacterium-mediated transformation EHA105 | U68/Tx623B | 成熟胚 Mature embryo | pCAMBIA1305.1 /pCUbi1390 | hpt | ubi1 | - | GFP | PCR/Western blot | 4.00 | [ |
农杆菌介导法 Agrobacterium-mediated transformation EHA105 | P898012 | 幼胚 Immature embryo | PHP78891 | - | ubi1 | - | GFP | PCR/Southern blot | 6.20 | [ |
农杆菌介导法 Agrobacterium-mediated transformation LBA4404 Thy- | Tx430/Macia/ Malisor84-7/ Tegemeo | 幼胚 Immature embryo | pPHP38332/ pPHP78152/ pPHP78233/ pPHP81561/ pPHP70444 | pmi/nptⅡ/ PTXD | ubi1 | 12.5 g·L-1甘露糖 Mannose/250 mg·L-1 遗传霉素Geneticin (G418)/300 mg·L-1 Phi | YFP | qPCR | 6.00-29.00 | [ |
农杆菌介导法 Agrobacterium-mediated transformation GV2260 | Tx430 | 幼胚 Immature embryo | pEKH2 | hpt | CaMV35S | 15 mg·L-1潮霉素 Hygromycin | GUS | PCR/Southern blot | 1.90 | [ |
农杆菌介导法 Agrobacterium-mediated transformation AGL1/EHA101 | P898012/ Btx623 | 幼胚 Immature embryo | PHP78891 | - | ubi1/Rab17/ Nos | - | GFP | 荧光显微镜 Fluorescence microscope | - | [ |
农杆菌介导法 Agrobacterium-mediated transformation EHA105 | BTx623 | 幼胚 Immature embryo | pMDC32- 35S-GFP | hpt | CaMV35S | 2-5 mg·L-1潮霉素 Hygromycin | GFP | PCR/RT-PCR/荧光显微镜 PCR/RT-PCR/Fluorescence microscope | 0.73 | [ |
农杆菌介导法 Agrobacterium-mediated transformation LBA4404 | Tx430/ Tx2737 | 幼穗/芽尖 Immature infloresences/ Shoot tip | pBI121 | nptⅡ | CaMV35S | 50-100 mg·L-1 卡那霉素Kanamycin | GUS | PCR/GUS assay | 4.20-14.30 | [ |
农杆菌介导法 Agrobacterium-mediated transformation LBA4404 Thy- | Tx430/Tx623/ Tx2752/Macia/ Malisor 84-7/ Tegemeo | 幼胚 Immature embryo | pPHP79066/ pPHP81814 | Hra/nptⅡ | Pltp/Axig1 | 250 mg·L-1遗传霉素 Geneticin (G418) | ZS- YELLOW1 | 荧光显微镜 Fluorescence microscope | 17.10-69.70 | [ |
农杆菌介导法 Agrobacterium-mediated transformation LBA4404 TD Thy- | Tx430 | 叶片 Leaf | PHP96037 | Hra | ubi1/Nos | - | - | - | 35.00-37.00 | [ |
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