葡萄（Vitis vinifera L.）是全球性重要经济果树，在栽培生产中极易遭受各种病虫害和干旱、高温等非生物逆境的威胁。究其原因，广泛用于栽培的欧亚种葡萄中抗性种质资源缺乏，而且传统杂交育种周期较长，严重影响葡萄抗逆育种进程。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术能实现对全基因组范围类目标基因的高效突变（功能失活），从而加速抗性基因挖掘、功能鉴定与抗性种质创新。目前，全球范围内已有利用CRISPR-Cas9在一次转化过程中实现葡萄中1个基因编辑或2个基因同时编辑的研究报道，但能否利用该体系快速、批量创制葡萄基因功能失活突变体尚不清楚。该研究针对葡萄MYB转录因子家族的138个成员，在基因保守区域与特异区域分别设置靶位点，共设计了265个sgRNA。采用分组混合的方法构建到基因编辑载体上，将所有重组质粒混合后转化农杆菌，通过对混池文库高通量测序，发现文库sgRNA覆盖率达67.17%，基因覆盖率高达90.58%，可用于遗传转化。将农杆菌混池文库与’赤霞珠’葡萄原胚团共培养，最终获得了1354株再生植株，其中有341株为转基因阳性植株，67株为基因编辑植株，共有8个MYB转录因子发生突变。通过表型分析，发现GSVIVT01026481001突变体对干旱胁迫的抗性显著增强。本研究为利用基因编辑技术创制木本植物突变体库提供了参考。