华山新麦草(2n=2x=14, NsNs)因具有诸多优异的农艺性状被认为是对普通小麦品种改良而言具有重要价值的野生近缘种。然而,尽管多个小麦-华山新麦草衍生后代的创制为优异性状的转移提供了种质资源基础,但小麦背景中华山新麦草染色体鉴定方法的滞后限制了对这些衍生后代的研究。本研究开发了三条高效非变性荧光原位杂交(ND-FISH)探针,其中HS-TZ3和HS-TZ4能特异性地结合华山新麦草染色体端粒区域,HS-TZ5可以和染色体着丝粒区域结合。华山新麦草染色体的FISH核型图和模式图被分别构建,以便于区分衍生系中所导入华山新麦草染色体的同源群归属。具体而言,染色体1Ns和2Ns在短臂和长臂上有相反的荧光信号,3Ns、4Ns和7Ns有叠加的双色荧光信号,5Ns和6Ns仅在短臂有荧光信号,7Ns在长臂的中间区域也有荧光信号。此外,评估了在不同组合方式下利用低密度单核苷酸多态性(SNP)芯片鉴定外源导入系的效果。结果表明最佳的模式是统计分析每条染色体上SNP位点的纯合率,15K SNP芯片可以广泛应用于附加系、代换系和易位系的鉴定,而40K SNP芯片在小麦和外源染色体易位区段的鉴定中最准确。本研究提供了基于ND-FISH和SNP芯片识别小麦背景中华山新麦草染色体同源群归属的简便方法,对于小麦-华山新麦草衍生系的高效鉴别和Ns染色体的进一步利用具有重要意义。