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    专题:流感病毒对人类和畜牧业健康的影响 栏目所有文章列表
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    1. 专题导读:流感病毒对人类和畜牧业健康的影响
    王秀荣,陈化兰
    2015, 48 (15): 3038-3039.   DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.013
    摘要491)   HTML8)    PDF (210KB)(564)    收藏
        流感病毒是一种分节段的、有囊膜包裹的负链RNA病毒,属于正黏病毒科。根据其内部NP和M的不同,分为A、B、C三型[1]。到目前为止,禽流感(avian influenza,AI)只由A型流感病毒引起,B、C型流感病毒尚未在禽类体内发现。自然界中,A型流感病毒的宿主范围相当广泛,猪、马、虎、水貂、狐狸、猫、鲸、禽类以及人体内都分离到A型流感病毒,是人畜共患的重要呼吸道疾病病原,具有特殊的重要性。
        A型流感病毒基因组由8个片段组成,从大到小依次为PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS,共编码11种病毒蛋白[2]。HA、NA与NP、M1、M2、PB1、PB2、PA共同构成病毒的组成成分,根据HA的不同将A型流感病毒进一步分为18个亚型。其中,H1—H16都能在禽类中发现,而H17—H18目前只在蝙蝠体内发现[3]。不同宿主中亚型分布存在差异,H1、H3在人群中广泛传播,H5、H7、H9在家禽体内流行广泛,野生水禽则是AIV的主要自然宿主,可以分离到H1—H16亚型的病毒,病毒在水禽体内长期存在而不表现明显临床症状。NS1蛋白能够直接调控病毒的复制过程,NS2介导病毒核糖核蛋白复合物的转运过程。后发现的PB1-F2蛋白与流感病毒介导的细胞凋亡有关[4]
        众所周知,1918年的西班牙H1N1流感,造成了美国50万人死亡,全球至少5 000万人死亡。近来利用反向遗传技术救获的来源于 1918 年流感基因的病毒相关研究表明,在动物模型中,1918年流感病毒 HA 基因对小鼠模型毒性增强起到了重要作用[5]。另外,1957 年亚洲H2N2流感造成 100 万人死亡,1968 年香港H3N2流感估计造成200万人死亡。2009 年暴发的 H1N1 大流感,到 2010423共引起超过17 853人死亡,该毒株致死率不高,但新病毒以前所未有的速度传播,在大约8周内传播到120个国家和地区,几乎所有国家都有报道。流感病毒对人类健康、社会发展和经济增长具有巨大影响及冲击。
      禽流感是A型流感病毒感染各种禽类的总称,对家禽养殖业危害非常严重。根据致病性不同,禽流感又划分为高致病性禽流感(high pathogenic avian influenza,HPAI)和低致病性禽流感(low pathogenic avian influenza,LPAI)。影响最大的是H5亚型HPAI,已在60多个国家的家禽和野鸟中检测出该亚型病毒,而且,在一些国家,主要是中国、印度、印度尼西亚、孟加拉国、埃及和越南,H5N1亚型禽流感已经发展成为危害养禽业健康发展的头号重要病原。不仅仅是H5N1,与H5亚型组合的还有2008年台湾爆发的H5N2亚型AI疫情[6],2014年初在日本和韩国爆发的H5N8亚型AI[7],今年美国也受到H5N8的严重影响,给养禽业造成重大损失。除H5亚型外,H7亚型HPAI也对家禽造成严重危害,2003年,荷兰、比利时以及德国等国家出现H7N7亚型HPAI[8],短短几周,荷兰共有约900个农场内的1 400万只家禽被隔离,1 800多万只病鸡被宰杀,引发H7N7禽流感蔓延欧洲。LPAI病毒通常不引起明显临床症状,但可引起鸡群生产性能下降,伴有其他疾病混合感染,环境影响时可造成严重后果,目前家禽体内流行广泛的LPAI以H9亚型为主。该亚型1966 年被报道引起威斯康星州火鸡发病以来,已在多个国家被分离和报道,可以感染多种禽类,如鸡、鸭、鹌鹑、野鸡、鹧鸪、鸽、丝羽乌骨鸡、欧石鸡等。中国1994年首次分离到了H9N2亚型病毒,临床表现为禽产蛋量下降,死亡率不高。
        禽流感除直接影响养禽业的发展外,还出现了直接感染人,引起严重的公共卫生的问题。1997年香港首次爆发了H5N1亚型HPAI跨越宿主屏障直接感染人并致死亡的事件[9],截止到2015年5月,全球共报告了人感染高致病性H5N1禽流感840例,其中死亡447例。病例分布于16个国家,其中,中国发现52例,死亡31例[10]。感染H5N1禽流感的多为年轻人和儿童。从1996—2012 年间,在荷兰、意大利、加拿大、美国、墨西哥和英国有报告人感染H7N2、H7N3 和 H7N7亚型流感病毒的事件,除荷兰有1人死亡以外,其他感染者大多仅有结膜炎和轻微的上呼吸道症状。在2013年3月,中国首次出现了人感染H7N9亚型流感病例,患者临床表现均类似于流感症状,早期主要为呼吸道症状,体温升高、咳嗽等症状,很快变成严重肺炎并出现呼吸困难。这是第一次报告人感染该亚型病毒,对人类健康造成了严重危害,引起广泛关注的事例。此外,还陆续发现了H9N2和H10N8等亚型AI感染人事件,控制其在家禽中流行以降低传播给人类的潜在风险是十分必要的。
        禽流感病毒不仅可以跨越种间障碍直接感染人,还为人的新型流感病毒提供供体基因。有证据表明 1918 年西班牙大流感是由 H1N1 禽流感传染给人类而引起的;1957 年亚洲大流感是由 人H1N1流感重组了禽H2N2流感PB1、HA 和 NA三个基因片段而引起的;1968 年,人H3N2亚型流感是由禽源 H3病毒提供 PB1和HA基因,由1957年大流感提供其他内部基因而形成的重组毒株,重组后成为一个新的大流行毒株;2009年H1N1大流感是来源于北美猪群中流行的三源重组毒[11],其PB2和PA来源于禽类;2013年人感染的H7N9流感病毒,其内部基因来自于H9N2禽流感病毒[12]。人类历史上出现的这几次大流行的流感病毒都与禽流感密切相关。
        本专题围绕目前中国兽医行业内流感研究工作新进展,集中报道了来自禽或猪体内流感病毒的生物信息学、致病机理和诊断技术等方面的研究成果。通过学术交流和讨论,加大对流感的宣传,促进公众对流感的认知,有助于提高人类对流感的防范意识,尽可能降低流感对社会秩序、食品安全和人类自身健康造成的冲击和负面影响。
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    2. 一株鸭源H4N8亚型禽流感病毒的全基因测序及遗传进化分析
    赵晴晴,李群辉,朱杰,钟蕾,刘晶晶,顾敏,王晓泉,刘文博,刘秀梵
    2015, 48 (15): 3040-3049.   DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.014
    摘要510)   HTML6)    PDF (442KB)(575)    收藏
    【目的】禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)根据其表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin, HA)和神经氨酸(neuraminidase, NA)的不同,可分为16种HA和9种NA亚型。根据其致病力的差异可分为高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus, HPAIV)和低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus, LPAIV)。虽然H4亚型禽流感病毒为低致病性AIV,感染家禽表现为无症状感染,但其对禽类甚至是哺乳动物是一个潜在的威胁,因此必须要加强对H4亚型禽流感病毒的调查监控。【方法】为了探讨H4亚型禽流感病毒的分子特征及遗传演化规律,对2010年在中国华东地区某活禽市场进行流行病学监测时分离到的一株H4N8亚型禽流感病毒A/duck/Nanjing/1102/2010(简称DK/NJ /1102)进行了全基因组序列测定及遗传进化分析。通过常规的血清学试验确定其HA亚型,提取病毒总RNA,并通过RT-PCR方法分别扩增出其各基因片段,连接 pGEM-Teasy载体上后进行序列测定。利用GenBank中的BLAST工具进行核苷酸序列的同源性分析,并与GeneBank 中的H4亚型流感病毒及其它相关序列进行遗传进化分析。【结果】DK/NJ/1102的HA基因与Mongolia 分离株A/duck/Mongolia/274/2007(H4N3)的核苷酸同源性最高,为98.9%。推导的氨基酸剪切位点序列为“P-E-K-A-S-R-G”,符合典型的低致病性禽流感病毒特征;NA基因与华东地区分离的鸭源毒株A/Duck/Eastern China/n91/2009(H3N8)核苷酸同源性最高,达99.4%;PB1、PA和NP基因均与H1亚型禽流感病毒亲缘关系最近;M基因与A/wild duck/Korea/CSM4-12/2009(H5N1)核苷酸同源性最高,高达99.9%;NS基因与韩国2009年分离的H7N7亚型流感病毒遗传距离最近。NS1蛋白的80-84处氨基酸没有发生氨基酸缺失。【结论】该H4N8亚型禽流感病毒基因组构成比较复杂,可能是一株多基因重组病毒。
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    3. H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法建立
    王云鹤,包红梅,孙佳善,李雁冰,徐晓龙,王子龙,施建忠,曾显营,王秀荣,陈化兰
    2015, 48 (15): 3050-3055.   DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.015
    摘要401)   HTML3)    PDF (884KB)(502)    收藏
    【目的】2013年3月,中国国家卫生和计划生育委员会宣布在上海、安徽地区发现了人感染H7N9亚型流感病毒事件,由于这种新型重组H7N9流感病毒未曾有过感染人或者动物的报道,因此出现了一系列亟待解决的问题,引起了全世界范围的广泛关注。根据H7N9亚型禽流感病毒 HA和NA核苷酸序列,设计并合成靶基因为HA和NA的2对引物,建立快速检测H7N9亚型禽流感病毒的一步法RT-PCR检测方法。【方法】根据测序结果,用DNAStar生物软件进行同源性分析比较,选出H7和N9基因中高度保守且特异的核苷酸区域,用oligo6.0软件设计针对H7和N9基因的引物。用Trizol LS提取RNA,采用一步法Access RT-PCR扩增反应液,建立了一步法检测H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR 方法。以H7N9亚型流感病毒为阳性对照,其他亚型流感病毒以及新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊等其他禽病病原作为阴性对照,按所建立的反应体系和反应程序进行RT-PCR反应,验证所建立方法的特异性。对病毒含量为 106.5 EID50·mL-1 的 H7N9 亚型禽流感病毒尿囊液依次进行 10 倍倍比稀释,提取RNA用RT-PCR 方法检测,评价其敏感性。另外,采取双盲试验用荧光定量RT-PCR对该方法进行了比对验证。【结果】用H7亚型特异性引物检测 H1—H15 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原,除H7亚型流感病毒外,其他样品均为阴性;用N9亚型特异性引物检测N1—N9 亚型禽流感病毒和其他禽病病原,仅当前流行的H7N9 亚型 AIV 样品有特异性目的条带,与其他N1—N9 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原均无交叉反应。通过对 H7N9亚型禽流感病毒尿囊液进行10倍倍比稀释检测,证实该方法最低检出量为 1.4×102.5 EID50·mL-1,并可以从阳性棉拭子浸出液中扩增出目的基因片段。【结论】该RT-PCR 方法具有特异性强和准确率高的特点,可以作为H7N9亚型AIV核酸检测的一种有效候选方法。
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    4. H9N2亚型AIV鼠肺适应株的获得及其氨基酸变异分析
    丁洁,高玉伟,桑晓宇,程凯慧,于志君,张坤,柴洪亮,王铁成,夏咸柱,华育平
    2015, 48 (15): 3056-3063.   DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.016
    摘要387)   HTML2)    PDF (3603KB)(308)    收藏
    【目的】将H9N2亚型禽流感病毒在豚鼠体内连续性传播9代后,能够稳定的在豚鼠间传播,可见H9N2亚型禽流感病毒对哺乳动物的感染能力以及在哺乳动物间传播的能力还是很强的。因此,使用此株病毒A/Chicken/Jinan/Li-2/2010(H9N2)简称JN,应用小鼠动物模型,研究H9N2亚型流感病毒在小鼠肺内适应性传代后对小鼠的致病力,以及传代过程中流感病毒的变异。检测和筛选流感病毒致病性变异的关键氨基酸位点,探索H9N2亚型流感病毒变异的分子机制。【方法】将一株H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Jinan/Li-2/2010(H9N2)在小鼠的肺脏进行传代,将小鼠解剖、摘除肺部、研磨离心后经滴鼻接种下一代小鼠,传播九代后,用MDCK细胞扩繁病毒,得到鼠肺适应株JN-P9-2-M1;扩增、克隆传代病毒JN-P5-2-M1和JN-P9-2-M1的全基因测序,推断各基因编码的氨基酸,与JN原代病毒(P0)的核苷酸和氨基酸相比对,得到各代次病毒核苷酸与氨基酸变化的位点;解剖小鼠,获得小鼠的肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、脑和肠,滴定各组织中的病毒滴度,检测病毒的组织噬性;乙醚麻醉小鼠后,每个病毒稀释度鼻内接种3只小鼠,检测小鼠的幸存率和发病率;采集攻毒小鼠的肺部,固定后进行病理切片和免疫组化,比较JN原代病毒与JN-P9-2-M1对小鼠肺部的损害。【结果】JN-P9-2-M1对小鼠的致病性明显提高,其MLD50为103.5EID50,106EID50、105EID50、104EID50攻毒剂量的小鼠幸存率是0,而原毒JN对小鼠不致死,JN-P9-2-M1对小鼠的致病性比原毒提高了至少1 000倍;攻入JN-P9-2-M1病毒剂量为106—103EID50的小鼠,体重明显减少,临床症状也很明显,攻毒后3—8 d,小鼠表现精神萎靡、被毛零乱、呼吸急促、弓背等症状,而原毒JN在106EID50时,小鼠的体重变化率都跟阴性对照组相似;JN-P5-2-M1和JN-P9-2-M1同原毒JN的受体结合特性相同,都是只能特异性结合SAa-2,6Gal受体,具有人样流感病毒的受体结合特性;JN病毒仅能在小鼠肺部检测到,病毒滴度很高,而JN-P9-2-M1不仅在小鼠肺部有很高的滴度,在小鼠的肝脏、脾脏、肾脏和脑部都能检测到。【结论】 JN-P9-2-M1对小鼠的致病性明显提高,比原毒提高了至少1 000倍;PB2 E627K、HA N313D和HA N496S等3个位点可能是病毒对小鼠致病力初步提高的原因,而PA L342I和NA N218T这两个点突变,就有可能是进一步提高病毒对小鼠致病力的关键位点。
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    5. H9亚型AIV型特异性电化学发光免疫检测方法的建立
    亓文宝,李芳,李华楠,黄丽红,和君,穆光慧,罗开健,廖明
    2015, 48 (15): 3064-3070.   DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.017
    摘要442)   HTML1)    PDF (614KB)(885)    收藏
    【目的】H9亚型禽流感是重要的人兽共患性传染病,该亚型病毒为H7N9亚型和H10N8亚型流感病毒提供了6个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M、NS),并且一直处于动态重组过程中。因此,建立针对H9亚型禽流感的型特异性电化学发光免疫的高通量快速检测方法,加强H9亚型流感的监测,具有重要意义。【方法】用钌联吡啶标记H9亚型AIV的单克隆抗体,用MPI-E型电致化学发光分析系统评价钌标单抗标记效率;用生物素标记H9亚型AIV的多克隆抗体,HABA法检测抗体生物素化的效率;待测抗原与钌标单抗作用1 h后,将此抗原-抗体复合物与通过生物素-链霉亲和素系统固定在磁微球表面的多克隆抗体反应,最后加入反应底物三丙胺后即可在电化学分析系统进行发光检测。优化生物素化多抗和钌标单抗最佳工作浓度,确定临界值和反应谱,对所建立的方法进行敏感性、特异性和重复性试验。攻毒后3 d和5 d,采集攻毒组和空白对照组鸡只的88份咽拭子和肛拭子,分别用电化学发光免疫检测方法和鸡胚病毒分离法进行检测和比较。【结果】钌标抗H9亚型AIV单克隆抗体的标记效率为每个单抗IgG分子上结合21个Ru2+,且间接免疫荧光方法证明其仍具有生物活性;生物素化兔抗H9N2亚型AIV多克隆抗体的标记效率为每个IgG分子上结合了6个生物素分子,且Western blotting试验证明其仍保持生物活性;该方法的检测临界值为28.3,可疑区间为23.4—33.2;阴性和阳性变异系数均小于10%;检测限为5×104EID50,能够特异性地检测H9亚型AIV,不与其他亚型流感病毒(H1、H3、H4、H5和H6亚型)和其他类型的禽源病毒(NDV、IBV和IBDV)反应。3 h内即可完成检测,与鸡胚病毒分离法的符合率为86.4%。【结论】所建立的H9亚型AIV型特异性电化学发光免疫检测方法可以用于临床样品检测,对H9亚型禽流感的监测和防控具有重要意义。
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    6. 一株H1N1猪流感病毒的进化分析与分子特征
    徐汇洋,许榜丰,陈艳,隋金钰,杨焕良,尹航,杨大为,乔传玲,陈化兰
    2015, 48 (15): 3071-3078.   DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.018
    摘要407)   HTML5)    PDF (695KB)(475)    收藏
    【目的】了解猪流感病毒的分子流行病学,为动物流感的防控提供科学依据。【方法】将猪的鼻拭子接种鸡胚进行病毒分离,对血凝试验阳性的样品在SPF鸡胚上进一步纯化、增殖,采用RT-PCR对分离毒株的全基因组进行扩增,使用Applied Biosystems 3500xL Genetic Analyzer进行序列测定,利用DNASTAR软件对测序基因片段进行整个阅读框的核苷酸序列同源性比对分析,并用 MEGA 6.0绘制遗传进化树及分析氨基酸位点。【结果】分离毒株A/swine/Zhejiang/245/2013(SW/ZJ/245/13)为H1N1亚型病毒,核苷酸的分析结果发现该分离毒株的8个基因片段均与中国近期分离的H1N1亚型流感病毒高度同源,属于类禽型猪H1N1的进化分支,没有出现不同基因型流感病毒片段之间的重组。分离株HA蛋白的裂解位点序列为IPSIQSR↓G,具有典型低致病力流感病毒的分子特征;HA蛋白5个抗原位点区域与其同源性最高毒株完全一致,表明抗原性未发生改变;HA蛋白受体结合位点中190 D以及225 E,表明SW/ZJ/245/13与SA-α-2,6-Gal受体有较强的结合能力,而SA-α-2,6-Gal受体普遍存在于哺乳动物宿主(猪和人)上呼吸道中;HA共有6个潜在糖基化位点,其中4个(N27、N40、N212和N291)位于HAl区,2个(N498和N557)位于HA2区;NA有7个潜在糖基化位点,其中4个(N50、N58、N63和N68)在链接区,其他3个(N88、N146和N235)在结构域;PB2蛋白具有271T、627E和701N的氨基酸组合;M2蛋白发生抗药位点S31N的突变。【结论】 类禽型H1N1猪流感病毒的持续存在和不断变异,提示应加强猪流感的监测,为动物流感的防控提供重要的科学依据。
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