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1. 昆虫几丁质代谢与植物保护

张建珍

2014, 47 (7): 1301-1302. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.006

摘要（429）

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2. 昆虫糖基水解酶20家族β-N-乙酰己糖胺酶研究进展

屈明博, 刘田, 陈磊, 陈琦, 杨青

2014, 47 (7): 1303-1312. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.007

摘要（468）

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糖基水解酶20家族β-N-乙酰己糖胺酶是N-乙酰己糖胺代谢过程中一个重要的酶，其可将位于非还原端以β糖苷键连接的N-乙酰己糖胺从寡糖及糖复合物中水解下来。昆虫糖基水解酶20家族β-N-乙酰己糖胺酶参与昆虫多个生理过程，包括表皮几丁质水解、蛋白质N糖基化修饰、糖复合物水解及精卵识别，因此可能成为生态农药设计的潜在靶标，受到国内外学者的普遍关注。根据昆虫20家族β-N-乙酰己糖胺酶的进化关系和生理功能，可以将其分为4个亚家族，分别为Hex1、Hex2、Hex3和Hex4。Hex1主要在昆虫蜕皮时期的表皮中表达，RNA干扰该基因能够导致昆虫在发育过程中不能正常蜕皮而死亡。通过酶学性质研究发现，Hex1能够专一性水解以β 1-4糖苷键连接的几丁质寡糖底物，而不能水解以其他形式连接的底物，是专一性的参与几丁质水解的β-N-乙酰己糖胺酶。目前获得的唯一一个昆虫β-N-乙酰己糖胺酶的晶体结构来自于亚洲玉米螟的OfHex1，其参与底物结合的“+1”位点存在一个特殊的三明治结构，使得Hex1对几丁质寡糖具有高度的选择性和水解活性。Hex2在双翅目昆虫中并不存在，与人类的β-N-乙酰己糖胺酶具有高度的相似性，RNA干扰该基因的表达能够导致幼虫化蛹时异常，成虫翅、附肢、触角等异常。通过酶学性质研究表明，Hex2能够水解释放几丁质寡糖，糖复合物等底物中的β-N-乙酰己糖胺，具有广泛的底物谱。Hex2的功能可能与人类Hex酶的功能类似，参与糖复合物的水解。Hex3是目前研究较少的一类β-N-乙酰己糖胺酶，RNA干扰该基因的表达能够导致幼虫蜕皮过程异常。Hex3存在于昆虫蜕皮液中，与Hex1存在相互作用，可能形成二聚体。通过酶学性质研究表明，Hex3能够水解几丁质寡糖底物，但活性较弱，说明其可能参与几丁质的水解。此外，Hex3、Hex1和Hex4被发现存在于双翅目昆虫精子的表面，可能参与精卵识别过程。Hex4又被称为FDL，是因为该基因的缺失能够导致果蝇左右大脑发生融合（fused lobe）。它是另外一种具有严格底物选择性的β-N-乙酰己糖胺酶，能够专一性地水解糖复合物GnGn中α1-3分支上以β 1-2糖苷键连接的GlcNAc β 1-2Man，通过细胞定位研究表明Hex4主要存在于高尔基体当中。以上表明Hex4的主要功能是参与细胞内的糖基化修饰过程。尽管目前对于昆虫β-N-乙酰己糖胺酶的研究取得了很大的进展。对Hex1的功能、酶学性质和晶体结构研究得较为透彻，对于设计环境友好的杀虫剂具有较强的指导意义。但其他3种β-N-乙酰己糖胺酶在生理条件下如何发挥功能，以及4种β-N-乙酰己糖胺酶活性差异的结构基础并不是十分清楚。作者从进化关系、晶体结构、酶学性质和生理功能等方面对昆虫糖基水解酶20家族β-N-乙酰己糖胺酶的研究进展进行综述。

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3. 中华稻蝗几丁质酶基因10（OcCht10）的分子特性及功能

李大琪1, 王燕1, 张建琴1, 李涛1, 孙毅2, 张建珍1

2014, 47 (7): 1313-1320. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.008

摘要（483）

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【目的】获得中华稻蝗（Oxya chinensis）几丁质酶基因10（OcCht10）的cDNA序列，预测其功能域，并做聚类分析明确该基因的系统发育关系。绘制OcCht10在5龄若虫不同组织部位和发育时间的表达图谱，研究其在中华稻蝗蜕皮过程中的生物学功能，为害虫防治提供高效安全的候选基因。【方法】从中华稻蝗转录组数据库搜索OcCht10 cDNA片段，经过blast分析、比对、拼接后，翻译为氨基酸序列，预测其功能域，并与其他昆虫几丁质酶家族基因进行聚类分析，进一步确认该基因的系统发育关系并进行准确命名；选取中华稻蝗5龄第6天不同组织部位及5龄若虫不同天数表皮样本，总RNA提取后反转录为cDNA模板，采用Real-time quantitative PCR（qPCR）方法获得OcCht10在5龄稻蝗若虫不同组织部位和不同发育阶段的表达谱；设计OcCht10 dsRNA引物，用试剂盒体外合成dsOcCht10，采用注射法进行RNA干扰；取注射24 h稻蝗表皮样本，用qPCR方法检测OcCht10基因沉默效率；并仔细观察dsRNA注射后稻蝗表型，统计其死亡率。【结果】经对中华稻蝗转录组数据库的搜索，获得OcCht10 cDNA片段长度为9 318 bp，开放阅读框为8 613 bp，编码2 870个氨基酸；其3′非编码区为705 bp，推测OcCht10 5'端有500多碱基尚未获得；预测其氨基酸序列具有多个结构域，包含有5个几丁质酶催化域和6个几丁质结合域；与其他昆虫几丁质酶基因聚类分析结果显示OcCht10属于昆虫几丁质酶家族基因Ⅱ组，该组基因与昆虫蜕皮相关；5龄若虫组织特异性分析表明该基因主要在表皮、前肠和后肠等外胚层发育而成的组织器官中表达，提示OcCht10可能参与表皮几丁质代谢；发育时间表达图谱表明该基因在5龄第6—7天，即蜕皮前的表皮中高表达，表明OcCht10可能负责蜕皮时表皮几丁质降解；5龄若虫第2天注射该基因的dsRNA，24 h后取表皮检测其干扰效率，结果显示该基因被沉默70%；与注射dsGFP的对照组相比，注射dsOcCht10 5龄若虫表现为龄期延长，旧表皮无法开裂，蜕皮受阻，昆虫无法正常活动导致死亡，死亡率达到100%。【结论】获得OcCht10的部分cDNA序列，该基因在昆虫蜕皮前表皮中高表达；OcCht10参与中华稻蝗的蜕皮发育，注射dsOcCht10可有效沉默靶基因，并导致试虫无法完成正常蜕皮而死亡。

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4. 中华稻蝗几丁质脱乙酰基酶2基因的分子特性和生物学功能

于荣荣, 丁国伟, 郭亚平, 马恩波, 张建珍

2014, 47 (7): 1321-1329. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.009

摘要（463）

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【目的】研究中华稻蝗（Oxya chinensis）几丁质脱乙酰基酶（chitin deacetylase，CDA）基因的分子特性和生物学功能，为新型农药靶标筛选提供科学依据。【方法】采用生物信息学方法在稻蝗转录组数据库中搜索获得几丁质脱乙酰基酶基因cDNA序列，对其进行保守区域分析，选取赤拟谷盗（Tribolium castaneum）、果蝇（Drosophila melanogaster）、冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）、家蚕（Bombyx mori）和云杉卷叶蛾（Choristoneura fumiferana）等昆虫物种的同源序列与中华稻蝗几丁质脱乙酰基酶氨基酸序列进行聚类分析，进一步构建系统发育树；运用real-time PCR方法检测几丁质脱乙酰基酶基因在中华稻蝗5龄若虫不同组织部位和不同发育天数表皮中的表达特性；进一步采用RNA干扰（RNAi）技术研究该基因对中华稻蝗蜕皮发育的影响。【结果】在中华稻蝗转录组数据库中搜索获得2条几丁质脱乙酰基酶基因的cDNA全长序列，生物学软件分析其氨基酸，发现2条序列均具有信号肽，开放阅读框包含3个几丁质脱乙酰基酶保守区域：几丁质结合区（ChBD）、低密度脂蛋白受体区（LDLa）和几丁质脱乙酰基催化结合域（CDA）。聚类分析表明2条序列分别与所选用的5种昆虫CDA2聚为一支。剪切子聚类分析发现2条序列分别与5种昆虫CDA2a和CDA2b相聚为一支，综合序列分析和聚类结果，认为所获得的序列属于几丁质脱乙酰基酶2基因的2个不同剪切子，分别命名为OcCDA2a和OcCDA2b。定量PCR分析表明OcCDA2a和OcCDA2b均在中华稻蝗表皮、前肠和后肠中高表达；在5龄第1天的表皮中表达量较高，之后逐步下降，蜕皮前又略有上升；RNAi研究发现5龄第2天的若虫注射dsOcCDA2a或dsOcCDA2b 24 h后，与注射dsGFP的对照相比，目的基因表达量显著降低，沉默效率分别为96.72%和80.43%；进一步观察试虫的表型，与对照组相比，注射dsOcCDA2和dsOcCDA2a的大多数虫体出现龄期延长，脊线开裂，旧表皮不能顺利剥离而导致虫体扭曲，最终死亡。少数若虫在蜕皮前死亡，未出现异常表型，部分若虫虽蜕至成虫，但四肢无力，行动缓慢。死亡率分别达到87.5%和94.4%；注射dsOcCDA2b的试虫无可见表型，可正常蜕皮发育至成虫。【结论】中华稻蝗几丁质脱乙酰基酶2基因具有2个剪切子，分别为OcCDA2a和OcCDA2b。OcCDA2a参与虫体蜕皮，对其生长发育起着重要的作用，该基因的沉默导致中华稻蝗因蜕皮困难而死亡，而OcCDA2b对中华稻蝗的生长发育没有影响。

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5. 飞蝗几丁质合成酶2基因的表达特性、功能及调控

刘晓健, 崔淼, 李大琪, 张欢欢, 杨美玲, 张建珍

2014, 47 (7): 1330-1340. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.010

摘要（550）

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【目的】几丁质合成酶（chitin synthase，CHS）是昆虫几丁质合成过程中的关键酶之一，由于高等动物不存在该酶，而被认为是设计安全高效杀虫剂的潜在靶标。论文在已克隆得到飞蝗几丁质合成酶2基因cDNA序列（LmCHS2，GenBank登录号：GU067731）的基础上，进一步深入探讨该基因在不同发育时期的表达特性、功能及调控，为基于RNA干扰技术的飞蝗有效控制提供科学依据。【方法】根据已知LmCHS2 基因核苷酸序列，设计特异性表达引物，运用RT-qPCR技术研究该基因在卵、若虫及成虫期的表达特性；体外合成LmCHS2的dsRNA后，分别注射至成虫期第1天的雌虫和雄虫，收集第5天的中肠样本提取RNA，反转录成cDNA后，采用RT-qPCR方法检测LmCHS2沉默效果。解剖飞蝗整个肠道后，观察中肠的形态变化及围食膜的完整性，探讨该基因在成虫期的生物学功能；饥饿处理飞蝗不同时间后，再重新进食，观察试虫肠道的变化，进一步运用RT-qPCR技术检测LmCHS2的表达。【结果】LmCHS2在飞蝗卵发育的前期和中期几乎没有可检测到的表达，卵发育后期表达量急剧上升，在4龄、5龄若虫和成虫期稳定表达；分别对羽化后第1天的雌、雄成虫注射dsCHS2，与对照组相比，处理组试虫LmCHS2表达量均显著下降，且取食量明显减少，雌虫和雄虫死亡率分别达78%和85%；解剖消化道后发现，注射dsCHS2后飞蝗中肠几乎不含有食物，中肠和胃盲囊长度显著缩短；对中肠的组织学观察结果表明对照组飞蝗围食膜发育完整，而注射dsCHS2后围食膜被严重破坏甚至缺失；饥饿处理飞蝗48 h后，与对照组相比，饥饿组中肠几乎不含有食物，长度亦显著缩短。H&E染色结果表明，饥饿组围食膜被严重破坏，对照组围食膜结构完整，与RNAi的结果非常相似；重新进食后围食膜发育良好；饥饿处理24 h和48 h后LmCHS2的表达被显著抑制，重新进食0.5 h后，其表达量快速上调，表明进食影响LmCHS2的表达。【结论】LmCHS2参与中肠围食膜的形成，对飞蝗的生长发育至关重要，该基因的沉默影响中肠围食膜的完整性，使飞蝗对食物的消化吸收困难，最终因饥饿而死亡；此外，该基因的表达受飞蝗进食的调控。

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6. 亚洲玉米螟两种漆酶基因OfLac1和OfLac2 cDNA 的克隆及基因表达

陈鹏, 屈明博, 杨君, 杨青

2014, 47 (7): 1341-1350. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.011

摘要（489）

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【目的】克隆亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）漆酶-1（OfLac1）和漆酶-2（OfLac2）基因；研究OfLac1和OfLac2在亚洲玉米螟不同发育阶段和不同组织中的表达特异性；分析蜕皮激素处理亚洲玉米螟后OfLac1和OfLac2基因表达量的变化；比较OfLac1和OfLac2表达模式的差别，推测其生理功能。【方法】根据已知的其他昆虫中Lac-1和Lac-2的保守氨基酸序列分别设计引物，以亚洲玉米螟白蛹时期提取的RNA反转录合成的cDNA为模板，通过PCR扩增OfLac1和OfLac2的保守区。然后根据所得的保守区片段分别设计基因特异性引物，采用RACE方法分别克隆OfLac1和OfLac2的3′和5′端序列，通过拼接获得OfLac1和OfLac2的基因全长。收集5龄第4天亚洲玉米螟的表皮、中肠、脂肪体、丝腺、气管、马氏管、精巢7种不同组织材料，通过半定量PCR分析OfLac1和OfLac2在不同组织中的基因表达模式。收集从卵到成虫29个不同生长发育时期的亚洲玉米螟作为材料，采用实时荧光定量PCR分析OfLac1和OfLac2在不同发育时期的基因表达水平。选取5龄第2天亚洲玉米螟幼虫进行蜕皮激素注射，分别在1、4、8、12和24 h后取样，利用实时荧光定量PCR研究OfLac1和OfLac2在蜕皮激素诱导下的基因表达水平。【结果】克隆获得亚洲玉米螟OfLac1和OfLac2的 cDNA序列。OfLac1全长3 065 bp，其中5′非编码区222 bp，3′非编码区440 bp，开放阅读框2 403 bp，共编码800个氨基酸，其编码的蛋白分子质量约为90.6 kD，理论等电点pI为5.34；OfLac2全长3 405 bp，其中5′非编码区162 bp，3′非编码区960 bp，开放阅读框2 283bp，共编码760个氨基酸，其编码的蛋白分子质量约为84.0 kD，理论等电点pI为6.43。通过SignalP分析发现，OfLac1在N端包含一个长为22个氨基酸的信号肽，OfLac2在N端包含一个长为23个氨基酸的信号肽，均为分泌蛋白质。基因表达模式分析表明，在发育过程中，OfLac1主要在成虫中表达，在其他发育时期表达量较低；OfLac2在每个幼虫龄期的末期表达水平上调，在幼虫化蛹过程中的预蛹期表达量最高；在不同组织中，OfLac1在马氏管和中肠中表达量最高，在气管和表皮中的表达量较低，在精巢、丝腺和脂肪体中几乎不表达；OfLac2在中肠和丝腺中表达量最高，在气管和表皮中的表达量较低，在精巢、马氏管和脂肪体中几乎检测不到表达。将蜕皮激素20E注射到亚洲玉米螟体内，OfLac1在注射24 h后表达量明显上调，OfLac2在注射12 h后表达量开始上调，在24 h后上调最明显。【结论】克隆得到亚洲玉米螟两种漆酶OfLac1和OfLac2的cDNA序列。两种漆酶基因的表达模式存在明显差别，但都受蜕皮激素的调控。OfLac2可能参与蜕皮过程表皮褐化。

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7. 甜菜夜蛾UAP的克隆、时空表达及RNAi研究

陈洁, 陈宏鑫, 姚琼, 张文庆

2014, 47 (7): 1351-1361. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.012

摘要（383）

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【目的】在昆虫中，几丁质的合成对于其生长发育至关重要，虽然几丁质合成通路在真菌中的研究比较深入，但是在昆虫中，目前大多数的研究都集中在海藻糖酶和几丁质合成酶方面，而对于通路上其他基因的研究却非常少。论文旨在阐明昆虫几丁质合成通路中的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶（UAP）对甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）几丁质合成酶基因和害虫存活的影响。【方法】以甜菜夜蛾5龄第1天幼虫的cDNA为模板，通过简并引物扩增出甜菜夜蛾UAP基因（SeUAP）的中间片段，然后利用特异性引物和RACE技术扩增出3′和5′ race序列，拼接得到cDNA全长。随后提取甜菜夜蛾各组织和各龄期的总RNA，并通过RT-PCR方法分析SeUAP在各个组织和龄期的表达情况。最后通过向甜菜夜蛾5龄第1天的幼虫注射dsUAP观察其生长状况，检测RNAi的效率以及对几丁质合成通路下游基因的影响。【结果】获得全长为2 098 bp的SeUAP cDNA，编码一个491个氨基酸残基的蛋白，与双翅目昆虫致倦库蚊、埃及伊蚊、黑腹果蝇和冈比亚按蚊的UAP亲缘关系较近。该基因在表皮和卵巢中大量表达，在气管和中肠中的表达次之，在马氏管中表达微弱，在脂肪体中则基本检测不到其转录本的存在。该基因在甜菜夜蛾生长发育的各个阶段均有表达，在卵的整个阶段、L22（幼虫2龄第2天）、L31、L42、L51、P0、P5、P7以及A3这些天中的表达量较高，其余天数表达量较低，其表达的高峰主要出现在几丁质需求量较高的时期。RNAi结果表明，通过向甜菜夜蛾5龄第1天的幼虫注射5 µg dsRNA，导致部分甜菜夜蛾出现蛹期畸形及死亡，并出现两种畸形现象：（1）虫体腹部蛹壳已基本形成并已硬化，但头部蛹壳形成有障碍，化蛹时无法突破旧表皮；（2）虫体头部蛹壳形成正常，也能正常突破旧表皮，但蜕皮过程仅到此为止，无法正常进行下去。定量PCR结果显示SeUAP的沉默对几丁质合成酶A基因（SeCHSA）下调不明显，而对几丁质合成酶B（SeCHSB）的表达有明显下调作用。【结论】UAP可以影响几丁质合成通路的下游基因并对甜菜夜蛾幼虫-蛹的生长发育起一定作用。

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