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1. 水禽传染病专题导读：加强水禽传染病的防控技术研究和技术储备

刘月焕

2016, 49 (14): 2792-2795. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.012

摘要（356）

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PDF （253KB）（426）

中国是世界水禽生产和消费大国，20世纪80年代以来，水禽产业发展速度较快，饲养量平均每年以5%—8%的速度递增^[1]，产肉量、产蛋量和产绒量均居世界第一，是中国畜牧业的重要组成部分及农民增收的重要经济来源之一。截止2014年，中国鸭、鹅存栏量分别为6.56亿只和 2.73亿只，分别占世界鸭、鹅总存栏量的58%和 83%，占中国家禽存栏量的12%和5%^[2]。

随着产业结构的调整，国内水禽业得到蓬勃发展，但同时由于集约化饲养、饲养水平参差不齐、管理经验缺乏和防疫技术滞后等原因，旧病如鸭瘟（鸭病毒性肠炎）、小鹅瘟和新发鸭坦布苏病毒病，鸭呼肠孤病毒病等疫病成为了制约产业健康发展的瓶颈。鸭瘟于1957年在中国首次报道^[3]，可感染鸭、鹅和其他雁形目禽类，主要造成水禽血管损伤、组织出血、消化道黏膜损伤、淋巴器官受损和实质性器官退行性病变，死亡率高，导致重大经济损失^[4]。小鹅瘟主要感染雏鹅和雏番鸭，被感染的水禽主要表现为精神委顿、食欲废绝、下痢，有时出现神经症状，发病率和死亡率可高达100%。常引起雏鹅大批死亡，对养鹅业的发展影响极大^[5]。鸭坦布苏病毒病于2010年首次在国内发现，造成产蛋鸭产蛋急剧下降，由于继发感染和饲养管理不当等因素可致死亡率达到15%—20%^[6-7^]。呼肠孤病毒病多发生于幼龄水禽，以肝脏和脾脏等组织出现坏死性病变为特征。2005年以来，出现了新型鸭呼肠孤病毒，病变又发生了新的变化，肝脏出现不规则块/斑块坏死和出血灶^[8]。

为减少水禽疫病的危害，了解和掌握病原的生物学特性，快速和准确诊断，提供有效和经济的免疫接种用疫苗，科研人员在这些方面开展了大量的研究，并取得了一定的成果。本期（49卷14期）刊登的“水禽病研究专题”，收集有7篇论文，3篇与鸭肠炎病毒(duck enteritis virus，DEV)相关，包括重组活载体疫苗的构建和胶体金快速诊断方法的建立；3篇与鸭坦布苏病毒（duck Tembusu virus，DTMUV）相关，分别是鸭坦布苏病毒病卵巢病理变化规律的研究、灭活疫苗母源抗体消长规律的研究，以及1株鸡胚致弱疫苗株选育的研究；1篇是鸭呼肠孤病毒（duck reovirus，DRV）人工感染SPF鸡胚的病理学研究。虽然研究内容不尽相同，但最终目的都是为有效控制水禽传染病提供科学依据和理论基础，为通过疫苗免疫防控水禽疫病做好技术储备。

鸭瘟（鸭病毒性肠炎），是鸭、鹅、天鹅的一种急性、热性、败血性传染病，病死率高，对养鸭业危害严重。快速诊断是控制鸭瘟的有效措施之一，赵丹丹等^[9]研究制备的DPV-gB蛋白单克隆抗体特异、稳定，建立的DPV胶体金检测技术相比PCR、ELISA、间接免疫荧光技术、微量中和试验等检测鸭瘟的方法^[10]，具有速度快、无需特殊仪器设备、操作简单等优点，为基层临床检测提供了一种快速简便的方法。目前预防鸭瘟的主要措施为疫苗免疫接种。常用的疫苗有鸡胚化弱毒活疫苗和灭活疫苗，活载体疫苗因为具有活疫苗的免疫效力高、成本低及灭活疫苗的安全性好等优点，而备受关注。鸭瘟病毒作为疫苗活载体的研究取得了显著的进展^[11-14]。本专题中，孙莹等^[15]成功构建的表达绿色荧光蛋白重组鸭肠炎病毒，将GFP-gpt表达盒插入到UL2基因，通过重组病毒生物学特性的研究证明UL2基因缺失后不影响DEV的免疫原性，是一个比较稳定的外源基因插入位点，为DEV活载体疫苗研究奠定了基础。而陈柳等^[16]构建了表达鹅细小病毒VP2蛋白的重组鸭瘟病毒，重组病毒细胞生长特性与亲本毒株基本一致，且重组病毒在感染细胞中能表达外源蛋白VP2，接种雏番鸭能诱导VP2特异性抗体生成，为研制小鹅瘟-鸭瘟二联活载体疫苗奠定了基础。

鸭坦布苏病毒病自从2010年流行以来，已经成为中国养鸭业的主要疾病之一。国内多家单位和科研人员^[17-23]进行了DTMUV灭活疫苗、弱毒活疫苗和载体疫苗的研究，并取得了良好的进展。鸭坦布苏病毒病灭活疫苗（HB株）和活疫苗（WF100株）先后获得国家一类新兽药注册证书。本专题中于可响等^[24]通过鸡胚连续传代成功获得了1株安全性高、免疫原性好的鸭坦布苏病毒鸡胚弱化毒株，为鸭坦布苏病活疫苗的研发奠定了基础。但不论是灭活疫苗、活疫苗还是基因工程疫苗，都需要建立疫苗的效力检定方法，其对疫苗质量控制至关重要。林健等^[25]通过系统研究DTMUV人工感染产蛋鸭的卵巢病变产生时间、病变检查内容和判定标准，在利用卵巢病变评价疫苗的效力时，为确定疫苗效力检验何时检查卵巢病理变化和如何判定病变卵巢提供了科学依据。韩春华等^[26]通过鸭坦布苏病毒病灭活疫苗母源抗体效力和消长规律的研究，给出了合理的鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的首免日龄。

关于在2003年开始流行于中国的鸭呼肠孤病毒，刘晓丽等^[27]利用分离的毒株建立了SPF鸡胚DRV感染模型，证明其能够在SPF鸡胚中复制增殖，并使雏鸡产生明显的病理变化，对鸡场DRV感染的防控提出了积极有效的意见。

水禽疫病的防控形势越来越严峻，过去认为水禽抵抗力强、疫病少的观点需要改变。在注重和加强生物安全措施的同时，免疫预防是防控疫病的重要措施，有效的疫苗是关键，但目前国内水禽专用疫苗种类有限。部分病原出现变异毒株或新的血清型，致病力改变，临床症状非典型化，原有疫苗的免疫保护效果不佳。还有一些新疫病尚无商品化疫苗可用。因此，加强水禽疫病诊断、防控技术研究和技术储备，特别是利用生物学技术开发的基因工程疫苗研究，可为有效控制水禽疫病提供科学合理的理论依据和切实可行的实施方案。

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2. 鸭瘟病毒单抗的制备及胶体金试纸条检测方法的建立

赵丹丹，杨国平，刁有祥，陈浩，提金凤，张璐，张英，李川川

2016, 49 (14): 2796-2804. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.013

摘要（428）

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【目的】鸭瘟（DP）是由鸭瘟病毒（DPV）引起的一种急性、败血性传染病，以头颈肿胀、食道黏膜和泄殖腔黏膜出血、黄白色溃疡，头颈部皮下有黄白色胶冻样渗出为特征。该病一旦发生，发病急、死亡快、死亡率高，对养鸭业危害严重。快速诊断是控制鸭瘟的重要措施之一，可以及时确定病原，以便采取有效的防制手段。试验旨在建立鸭瘟病毒（DPV）胶体金快速检测方法。【方法】利用生物学软件Protean分析，选择鸭瘟病毒抗原表位较多的一段序列设计引物，PCR扩增目的基因。连接到载体pMD-18T上，测序正确后再连接到原核表达载体pET-28a上。将获得的重组质粒转化至Rosetta感受态细胞中进行诱导表达。表达的蛋白经纯化后测其浓度并经Western blotting鉴定分析。以表达的DPV-gB蛋白作为抗原，免疫7周龄BALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，经间接ELISA筛选及亚克隆，获得DPV-gB特异性单克隆抗体。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，以制备的 H6F6单抗作为标记抗体（标记的最适pH为8.0—8.5，最佳标记浓度为15倍原液稀释），将纯化的A8D7单抗（浓度为2倍原液稀释）和羊抗鼠IgG（浓度为10倍稀释）包被在硝酸纤维素膜（NC）上，分别作为检测线和质控线，经条件优化建立了鸭瘟病毒胶体金试纸条检测方法。【结果】共获得4株能稳定分泌抗DPV-gB蛋白抗体的杂交瘤细胞株，命名为A8D7、E6C3、H11F8、H6F6。间接ELISA检测腹水效价分别为1:10³、1:10³、1:10⁵、1:10³。亚类鉴定结果分别为IgG2b、IgG2a、IgG2b、IgG1，轻链均为kappa链。Western blotting结果显示4株单抗均能与DPV-gB蛋白特异性结合。IFA结果显示制备的4株单抗是针对DPV产生的。建立的胶体金试纸条方法能够特异性地检测鸭瘟病毒，与鸭坦布苏病毒、H9N2亚型禽流感病毒、呼肠孤病毒、减蛋综合征病毒无反应。阳性尿囊液稀释50倍后用该试纸条检测依然为阳性；用不同批次的试纸条重复检测，结果无差异。利用制备的胶体金试纸条和PCR方法对38份临床样品进行检测比较，结果显示两者符合率为91.6 % 。【结论】本研究建立的试纸条检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性，可用于DPV的快速检测。

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3. 表达绿色荧光蛋白重组鸭肠炎病毒构建

孙莹，李俊平，黄小洁，李岭，曹明慧，李启红，李慧姣，杨承槐

2016, 49 (14): 2805-2812. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.014

摘要（348）

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【目的】鸭肠炎病毒(duck enteritis virus, DEV)不同毒株间存在明显差异，DEV疫苗株的UL2基因在195bp后连续缺失528bp，导致第65位氨基酸后连续缺失176aa^[1]。将绿色荧光蛋白（GFP）基因插入DEV UL2基因中，获得表达绿色荧光蛋白的重组病毒，以研究UL2基因对DEV生物特性的影响和探讨DEV作为载体表达外源基因的可行性。【方法】以实验室保存的DEV细胞适应株DNA为模板，利用PCR技术扩增出病毒UL2基因上下游序列并克隆入pMD-18T载体；以UL2基因作为外源基因插入靶点及同源重组臂，将CMV启动子控制的含有GFP-gpt基因表达盒克隆入DEV UL2基因中，构建含GFP基因的转移质粒载体pT-UL2-GFP-gpt；用脂质体将其与DEV细胞适应株共转染CEF细胞，待80%细胞出现病变后，冻融3次，接种到新鲜CEF细胞单层的6孔培养板中，用含5%血清、1%双抗、1%琼脂的M199培养液覆盖，在荧光显微镜下挑取单个有绿色荧光的蚀斑，再接到新的细胞上，重复蚀斑筛选、纯化表达绿色荧光蛋白的重组病毒；利用PCR、基因测序技术鉴定重组病毒；重组病毒接种CEF（moi=0.01），每12h取出1瓶接毒细胞，分别收集上清和细胞，测量其病毒含量，绘制一步生长曲线；重组病毒在CEF中连续传代20次，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，并用PCR检测GFP的传代稳定性；重组病毒免疫4周龄SPF鸭后14d，肌肉注射接种DEV强毒（CVCC AV1221），观察免疫保护情况。【结果】经双酶切鉴定，成功构建了含绿色荧光蛋白报告基因的转移质粒载体pT-UL2-GFP-gpt，将其与DEV共转染CEF细胞后8h，即可见转染细胞中有带有绿色荧光的梭形细胞，经过8轮蚀斑筛选，获得纯化的重组病毒rDEV-△UL2-GFP-gpt；PCR鉴定及基因测序结果显示，GFP标记基因成功地插入到DEV基因组中，替换了DEV UL2基因的196—723位核苷酸；一步生长曲线结果显示，重组病毒在细胞和上清中的病毒含量分别在36h和72h达到峰值，为10^6.2TCID₅₀/0.1mL、10^5.5TCID₅₀/0.1mL，与亲本毒无明显差异；重组病毒在CEF中连续传代，1—5代可以稳定表达GFP基因，第6代起，开始出现少量没有荧光的细胞病变，15—20代中绝大部分细胞病变无绿色荧光，GFP在细胞连续传代过程中容易出现突变；重组病毒以10^3.0TCID₅₀/只免疫麻鸭，免疫后14d能完全抵抗DEV强毒株的攻击，与亲本毒免疫原性一致。【结论】成功构建了表达绿色荧光蛋白的DEV，首次证实UL2基因缺失不影响其在细胞中的复制，也不影响其免疫原性，为DEV UL2基因功能、活载体疫苗研究奠定了基础。

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4. 表达小鹅瘟病毒VP2蛋白重组鸭瘟病毒的构建及其生物学特性

陈柳，余斌，倪征，华炯钢，叶伟成，云涛，张存

2016, 49 (14): 2813-2821. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.015

摘要（443）

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【目的】鸭瘟和小鹅瘟是番鸭和鹅的两种重要传染病，鸭瘟最主要的防治措施是定期接种鸭瘟病毒减毒活疫苗。根据2012年国际病毒分类委员会（ICTV）的报告，DEV被归为疱疹病毒科的α疱疹病毒亚科马立克氏病毒属。疱疹病毒如伪狂犬病毒、马立克氏病毒、火鸡疱疹病毒等已广泛用于病毒活载体的研究，而近几年也有关于鸭瘟病毒（DEV）作为疫苗活载体的报道。为了为免疫防控鸭瘟和小鹅瘟提供新手段，本研究拟在鸭瘟病毒疫苗株感染性克隆的基础上，构建表达小鹅瘟病毒（GPV）主要免疫原蛋白VP2的重组病毒rDEV-VP2，并研究其生物学特性，进而探讨重组病毒rDEV-VP2作为防治DEV和GPV的二联重组活载体疫苗的可能性。【方法】将密码子优化的GPV VP2基因通过常规基因克隆的方法插入转移载体pEP-BGH-end，构建含有GPV VP2表达框pCMV-VP2-BGH-pA的重组表达质粒。在鸭瘟病毒（DEV）疫苗株细菌人工染色体克隆pDEV-EF1的基础上，通过“Red E/T”两步重组法将GPV VP2基因表达框插入到DEV US7和US8基因之间构建了突变体克隆pDEV-VP2。利用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞（CEFs）拯救获得重组病毒rDEV-VP2和删除Bac质粒序列的rDEV-VP2-Cre，并对重组病毒细胞体外生长曲线、蚀斑大小和VP2蛋白表达情况进行测定。将rDEV-VP2接种番鸭，在不同时间采集血清，采用间接ELISA法检测血清中GPV VP2抗体产生情况。【结果】间接免疫荧光检测和Western blotting分析表明，外源蛋白VP2在CEFs细胞成功表达。病毒生长曲线和蚀斑大小测定结果显示，rDEV-VP2在CEFs细胞上的增殖滴度与亲本株相比无显著差异，表明外源基因VP2的插入不影响rDEV重组病毒的增殖。动物试验结果表明，7日龄雏番鸭接种rDEV-VP2可以诱导产生针对GPV VP2的抗体，免疫后3周抗体阳性率为50%（4/8）。【结论】本实验将小鹅瘟病毒的主要免疫原基因VP2插入到DEV疫苗株基因组的US7和US8基因间构建了表达该免疫原性基因的重组鸭瘟病毒细菌人工染色体，继而在鸡胚成纤维细胞（CEFs）上拯救获得了重组病毒rDEV-VP2，病毒细胞生长特性与亲本株基本一致，且能诱导鸭体产生GPV VP2特异性的抗体。该研究为研制DEV-GPV二联重组活载体疫苗奠定了基础。

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5. 鸭坦布苏病毒鸡胚弱化毒株的选育

于可响，马秀丽，袁小远，刘存霞，胡峰，凌红丽，李玉峰，黄兵

2016, 49 (14): 2822-2829. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.016

摘要（393）

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【目的】将鸭坦布苏病毒BZ_2010株在SPF鸡胚上进行连续传代致弱，旨在选育安全性高、免疫原性好的活疫苗候选毒株。【方法】以SPF鸡胚为增殖宿主，将BZ_2010株连续传代，直至第120代，以1日龄雏鸭和30周龄的产蛋种鸭为试验对象，对第120代次毒株（命名为VC2）的安全性进行评价；以1d雏鸭为试验对象，对VC2株的返强情况进行评价；以18周龄的种鸭为试验对象，对VC2株免疫后的中和抗体进行监测；以25周龄的种鸭为试验对象，对VC2株免疫后的保护效果进行评价；利用RT-PCR方法分别扩增BZ_2010株和VC2株的E基因和NS4A基因，进行测序分析。【结果】传代病毒对鸡胚的平均死亡时间逐渐缩短，而病毒毒价有逐渐提高的趋势，ELD50由第20代的10^-5.3/0.1mL提高到第120代的10^-5.8/0.1mL，而且第80代之前提高较快，后期基本稳定。将VC2株通过颈部皮下接种1d雏鸭和肌肉接种30周龄产蛋种鸭，接种后试验鸭无异常临床表现，肝脏也无明显病理变化，这说明VC2株具有良好的安全性。将VC2在1d雏鸭进行连续5次传代，未发现试验鸭有任何异常症状，将第5代组织悬液接种1d雏鸭，采集肝脏进行病理切片观察，发现无明显病理变化，这说明VC2株具有良好的稳定性。基因测序分析结果显示，VC2株 E蛋白的第86、157、189、301和312位氨基酸发生改变，而NS4A蛋白只有一个氨基酸发生突变，即第54位氨基酸由F变为L。VC2免疫种鸭后抗体水平上升很快，第4周即可达到高峰，并且维持较长时间；VC2免疫后于第2周和第50周利用强毒株进行攻毒试验，结果VC2免疫组在攻毒后未出现异常症状，粪便正常，产蛋率保持正常，这说明VC2株免疫可对强毒株的攻击产生完全保护。【结论】本研究通过鸡胚连续传代成功获得了一株安全性高、免疫原性好的鸭坦布苏病毒鸡胚弱化毒株。VC2免疫种鸭后抗体水平上升很快，可维持较长时间。攻毒试验结果表明，VC2株免疫可对强毒株的攻击产生完全保护。

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6. 鸭坦布苏病毒病卵巢病变标准的判定

林健，杨志远，何平有，段会娟，邹立宏，杨保收，赵际成，潘洁，王小蕾，刘立新，刘月焕

2016, 49 (14): 2830-2836. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.017

摘要（363）

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【目的】了解产蛋鸭感染鸭坦布苏病毒后卵巢病变产生的进程和卵巢病变规律，为采用产蛋鸭卵巢病理变化检查法进行疫苗效力检验提供依据。【方法】70只260日龄产蛋樱桃谷鸭，以0.5mL/只（含100DID50）的剂量经胸部肌肉接种鸭坦布苏病毒（HB株）强毒。观察试验鸭的临床症状，统计每日产蛋数和采食量。攻毒后2 d，每只鸭经翅静脉采血，分离血清，经卵黄囊途径接种5枚6日龄SPF鸡胚，每胚0.1mL。接种后置37℃条件下继续孵化，24 h死亡鸡胚弃去。采用RT-PCR方法测定24—72 h死亡鸡胚的DTMUV核酸，将1/5或以上鸡胚死亡且DTMUV核酸阳性的鸭判为DTMUV感染鸭。攻毒后4—10 d，每日剖杀10只鸭，观察和分析生殖系统病变。统计病变率，检查输卵管内是否有蛋，卵泡是否变形、出血和破裂,依据病变率和病变，确定检查内容和病变卵巢的判定时间和标准。【结果】（1）攻毒后3、4、5、6 d，鸭几乎不采食，产蛋数明显下降。攻毒后7 d，鸭精神状况好转；攻毒后8 d，采食量开始回升。（2）70只鸭中，除1只鸭的病毒分离结果为阴性外，其余69只鸭的病毒分离结果均为阳性，病毒分离阳性率为98.6%（69/70）。（3）攻毒后4—10 d，共64只产蛋期鸭的生殖器官可以判定。（4）攻毒后4、5、6、7、8、9和10 d，卵巢病变率分别为66.7%（6/9）、100%（10/10）、100%（10/10）、100%（9/9）、100%（9/9）、100%（9/9）和100%（8/8）。（5）除攻毒后4 d有2只鸭输卵管中有蛋外，其余62只鸭输卵管中均无蛋，无蛋率为96.9%（62/64）。（6）攻毒后4—10 d，96.9%（62/64）鸭的卵泡变形，96.9%（62/64）鸭的卵泡出血，95.3%（61/64）鸭的卵泡变形和出血，34.4%（22/64）卵泡破裂。【结论】（1）确定卵巢病理变化检查时间为攻毒后7—8 d；（2）具有变形或出血病变之一，判病变卵泡。输卵管内无蛋且有3个及以上病变卵泡，判为病变卵巢。

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7. 鸭坦布苏病毒病灭活疫苗（HB株）母源抗体的消长规律

韩春华，赵际成，段会娟，林健，杨志远，谢佳，潘洁，王小蕾，刘立新，刘月焕

2016, 49 (14): 2837-2843. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.018

摘要（506）

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【目的】评价鸭坦布苏病毒病灭活疫苗母源抗体的效力，制定疫苗的最小免疫日龄。【方法】随机采集鸭坦布苏病毒病灭活疫苗（HB株）二免后135日樱桃谷种鸭的种蛋孵化，随机取5、7、10和15日龄免疫种鸭后裔雏鸭10只和相对应日龄非免疫种鸭后裔雏鸭5只，采血，分离血清，测定母源抗体，并以0.1mL/羽（含100DID₅₀）的剂量经腿部肌肉攻毒。观察雏鸭攻毒后的临床表现（采食量、粪便、精神和死亡情况），观察至攻毒后10d。攻毒后2d经颈静脉采血，分离血清进行病毒分离。每份血清接种5枚6日龄SPF鸡胚，0.1mL/枚，37℃孵化，24h以内死亡鸡胚视为非特异死亡，孵化至168h。只要有1枚及以上鸡胚死亡则判该鸭感染。计算母源抗体雏鸭组的攻毒保护率和无母源抗体组的发病率。攻毒后5d，分别称量雏鸭的体重，计算平均日增重。对成对样本进行T检验，分析母源抗体对雏鸭增重的影响。通过试验鸭中和抗体、增重变化和病毒分离的方法评价母源抗体的效力。【结果】（1）1日龄雏鸭的母源抗体阳性率最高，1、5、7、10和15日龄雏鸭的母源抗体阳性率分别为56.1%（37/66）、40%（4/10）、50%（5/10）、30%（3/10）和0%（0/10），5—7日龄抗体阳性率处于平台期，15日龄时母源抗体降低至全阴性；（2）攻毒后对照鸭表现精神沉郁（20/20）、仰翻和侧翻等神经症状（6/20）及死亡（2/20），有母源抗体的雏鸭临床症状明显轻于对照组。（3）5、7、10和15日龄免疫种蛋孵化雏鸭攻毒后5d平均增重115.5、142.8、177.8和162.2g。5、7、10和15日龄非免疫种蛋孵化雏鸭攻毒后5d平均增重54.5、91.0、165.0和118.8g。（4）5、7、10和15日龄免疫种蛋孵化雏鸭的攻毒保护率分别为50%（5/10）、60%（6/10）、20%（2/10）和0%（0/10）； 5、7、10和15日龄非免疫种蛋孵化雏鸭的发病率均为100%。（5）5和7日龄雏鸭平均增重和攻毒保护率最高，分别为50%（5/10）和60%（6/10），10和15日龄雏鸭的母源抗体尽管低（20%和0%）或阴性，仍然有明显的保护作用。【结论】（1）鸭坦布苏病毒病灭活疫苗母源抗体能够保护10日龄内雏鸭；（2）疫苗首次免疫的时间以7—10日龄为最佳。

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8. 鸭呼肠孤病毒人工感染SPF鸡胚的病理学研究

刘晓丽，刘婷，刘波，程国富，谷长勤，张万坡，胡薛英

2016, 49 (14): 2844-2849. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.019

摘要（394）

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PDF （2757KB）（465）

【目的】前人研究表明禽呼肠孤病毒可以经卵垂直传播, 禽呼肠孤病毒能引起雏禽的病毒性关节炎、呼吸道和肠道疾病、肝炎、心肌炎、免疫抑制等。以实验室分离的鸭呼肠孤病毒HP080421株为研究对象，该毒株引起病变主要以鸭软脚为主要临床特征，病鸭肝脏和脾脏表面有大量的白色坏死灶、肾脏肿大、出血为主要病变特点。研究了鸭呼肠孤病毒对鸡胚的致病性,通过雏鸡的病理变化特点,探讨所分离的HP080421鸭呼肠孤病毒株是否也可感染鸡群，旨在为鸡场鸭呼肠孤病毒感染的防控提供理论依据。【方法】运用华中农业大学兽医病理学实验室分离鉴定的HP080421株鸭呼肠孤病毒通过尿囊腔接种SPF鸡胚，建立SPF鸡胚鸭呼肠孤病毒感染模型，培养鸡胚至雏鸡出壳，运用临床观察、病理剖检、H.E染色和免疫组织化学染色等病理组织学检查方法，对鸭呼肠孤病毒感染SPF鸡胚进行病理学研究和致病性分析。【结果】研究发现病毒感染鸡胚孵化培养至22—23日龄均啄壳，但不能自主出壳，需人工剥壳。病理剖检可见雏鸡的肝脏、脾脏肿胀质脆，表面及实质分布有黄白色坏死灶；脑部组织肿胀，并可见出血点和出血斑。H.E染色的组织病理学观察可见接毒组雏鸡肝脏、脾脏的坏死灶周围有大量淋巴细胞浸润；法氏囊的滤泡髓质部和胸腺的髓质部淋巴细胞减少、缺失；脑、肺脏、肾脏存在不同程度的淤血、出血和水肿；免疫组织化学染色结果表明：病毒阳性信号主要分布于肝脏、脾脏、肺脏和法氏囊等器官，并且位于上皮细胞和巨噬细胞的细胞质和胞核内。【结论】鸭呼肠孤病毒株HP080421 能够在SPF鸡胚中复制增殖，并使雏鸡主要器官发生明显的病理变化，病理变化主要集中在肝脏和淋巴器官，因此鸭呼肠孤病毒可通过垂直传播感染鸡群，还可导致雏鸡免疫抑制。本研究通过SPF鸡胚鸭呼肠孤病毒感染模型，阐述了鸭呼肠孤病毒感染鸡群的可能性，因此在实际养殖过程中，养殖户要防止鸭呼肠孤病毒对鸡胚的污染，切断传播途径，以达到预防鸡群感染鸭呼肠孤病毒的目的。

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9. 猪瘟病毒分子流行病学信息系统的建立与应用

王琴, 涂长春, 黄保续, 徐璐, 盖华武, 范学政, 郭焕成, 徐和敏, 李金花, 赵启祖, 宁宜宝, 郑然, 沈青春

2013, 46 (11): 2363-2369. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.11.021

摘要（588）

PDF （771KB）（1119）

【目的】加强对猪瘟（CSF）流行病学信息的统一管理，随时掌握全球CSF数据，分析CSF传播来源，进行疫情预测预报。【方法】将猪瘟流行病学信息数据与数据库技术、GIS技术、生物信息学技术相结合。采用ArcGIS Desktop、ArcMapObjects、Delphi和DNAStar 6.0等软件工具，在中国数字地图空间数据的支持下，建立了猪瘟流行病学信息系统，并命名为CSFinfo。【结果】该系统包含754株中国流行毒株、554株中国CSFV E2基因序列和欧盟CSF参考实验室数据库的642株CSFV E2基因序列，使中国成为继德国之后第二个拥有这种数据库的国家。【结论】CSFinfo可方便、快捷地对某地某时的CSF疫情进行查询，分析疫病发生规律；由于CSFinfo含有DNAStar6.0序列分析软件，可实现空间数据与基因序列分析应用的完整结合，是该系统的一大创新。CSFinfo的建立对CSF流行病学监测提供了必要的技术支持，提高了对CSFV流行毒株总体分布、疫情发生发展趋势提供科学的统计分析手段，为政府CSF防控提供可靠的疫情资料具有十分重要的意义。

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10. 中药水提物对猪源耐四环素大肠杆菌的抑制活性

黄名钱, 孔祥峰, 肖莉春, 郭小权

2013, 46 (11): 2370-2376. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.11.022

摘要（626）

PDF （532KB）（660）

【目的】了解中药水提物对猪源耐四环素大肠杆菌的抑制活性，为其在养猪生产中的应用提供依据。【方法】纸片法测定10个猪源大肠杆菌分离株对四环素的敏感性，PCR方法测定其对四环素耐药基因的携带情况；琼脂扩散法和微量倍比稀释法测定中药水提物及其与四环素的混合物对10个猪源大肠杆菌分离株的抑制活性。【结果】10个受试菌株对四环素的耐药率达100%，部分或全部菌株携带tetA（10/10）、tetB（2/10）和tetC（9/10）等四环素耐药基因；山楂、五味子、连翘和金银花的水提物均有较强的抑菌活性，但与四环素混合后，其抑菌圈直径减小，最小抑菌浓度增大。【结论】受试菌株对四环素的耐药性可能由tetA、tetB和tetC等四环素耐药基因引起，测定的4种中药水提物对受试菌株均有抑制活性，但不宜与四环素联用。

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11. 绵羊UCP4基因编码序列的克隆和mRNA表达研究

周沙沙, 刘宝凤, 魏琳琳, 王景霖, 刘建华, 梁琛, 乔利英, 刘文忠

2013, 46 (10): 2110-2118. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.10.017

摘要（437）

PDF （735KB）（646）

【目的】克隆绵羊UCP4基因的编码序列（CDS），分析CDS及其编码蛋白结构特点，并探讨其mRNA的发育性表达规律，以期为该基因的结构和功能研究奠定理论基础。【方法】利用RT-PCR技术从绵羊大脑组织中扩增出该基因的编码区序列，运用生物信息学方法分析UCP4蛋白的理化性质和结构特点。利用实时荧光定量PCR技术，对两个具有显著尾型差异的绵羊品种（广灵大尾羊和小尾寒羊）2、4、6、8、10和12月龄共计96个个体的8种组织（大脑、小脑、下丘脑、垂体、皮下脂肪、肾周脂肪、肠系膜脂肪和尾部脂肪）进行mRNA表达研究。【结果】绵羊UCP4基因CDS区长972 bp，编码323个氨基酸，分子量为35.73 kDa，等电点为9.43。二级结构中α螺旋、β折叠股和环分别占56.04%、7.12%和36.84%。该蛋白为跨膜蛋白，无信号肽，但有2个糖基化位点和15个潜在的磷酸化位点。UCP4 mRNA在脑组织和脂肪组织中均有表达，但高表达于脑组织中。品种、月龄和组织对UCP4 mRNA表达均有显著影响。【结论】获得了绵羊UCP4 基因的CDS全序列，揭示了其mRNA的表达特征及其影响因素，对进一步研究该基因的结构及其与能量代谢的关系具有重要科学意义。

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12. 细胞型朊蛋白在BV2小神经胶质细胞体外激活中的作用

付永瑶, 师福山, 王继宏, 杨利峰, 周向梅, 尹晓敏, 赵德明

2013, 46 (9): 1932-1938. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.09.021

摘要（402）

PDF （557KB）（770）

【目的】研究细胞型朊蛋白对小神经胶质细胞不同激活方式的影响。【方法】用IFN-γ、IL-4和IL-10分别刺激BV2细胞，RT-PCR方法检测PrPC的mRNA表达量。SiRNA干扰将PrPC沉默，用上述因子刺激细胞，用RT-PCR和Western-blot检测相关参数。【结果】用IFN-γ、IL-4和IL-10分别刺激小神经胶质细胞后可导致PrPC的mRNA表达量下降；PrPC沉默后的小神经胶质细胞对IFN-γ刺激的反应应答减弱；PrPC沉默可以显著地改变由IL-4诱导的神经胶质细胞的激活表型；但是对IL-10诱导的小神经胶质细胞激活却没有影响。【结论】PrPC既能影响小神经胶质细胞从静止状态到激活状态的转换，也在小神经胶质细胞的经典激活和替代激活途径中发挥调节作用。

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13. Ghrelin和GHS-R1a mRNA在牛卵母细胞体外成熟过程中的表达

米焱, 张伶俐, 李海军, 杜晨光, 曹贵方

2013, 46 (9): 1939-1945. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.09.022

摘要（588）

PDF （597KB）（528）

【目的】探讨Ghrelin和GHS-R1a mRNA在牛卵母细胞体外成熟过程中的表达及二者表达与FSH之间的关系。【方法】利用实时定量RT-PCR技术检测体外成熟进程中牛卵母细胞Ghrelin和GHS-R1a mRNA水平表达变化，观察不同浓度FSH对Ghrelin和GHS-R1a mRNA表达的作用以及FSH与FSH受体抑制剂的组合对Ghrelin和GHS-R1a基因表达的影响。【结果】实时定量RT-PCR结果揭示牛卵母细胞Ghrelin和GHS-R1a mRNA的相对表达量随着成熟过程的延长而呈现一定变化规律，即Ghrelin和GHS-R1a mRNA在卵母细胞体外成熟过程中从8 h开始显著下降并持续此低表达水平到24 h；不同浓度FSH 显著抑制卵母细胞Ghrelin及GHS-R1a mRNA的表达，而FSH 受体抑制剂明显减弱FSH的抑制作用而促进二者表达。【结论】Ghrelin和GHS-R1a mRNA在卵母细胞体外成熟过程中的表达可能随着培养液中FSH升高而降低。

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14. 牛卵母细胞体外成熟技术研究进展

贾振伟, 田见晖, 安磊, 张家新

2013, 46 (8): 1716-1724. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.08.022

摘要（520）

PDF （483KB）（1088）

牛卵母细胞体外成熟是一项重要的繁殖生物技术，但是由于卵母细胞没有经历体内促黄体激素（LH）峰启动前的生长过程及生物事件干扰了胞质成熟，导致体外发育能力低于体内成熟的卵母细胞。卵母细胞成熟过程复杂，涉及细胞核、细胞质及分子成熟。牛卵母细胞体外成熟受多种因素影响，其中包括卵母细胞来源、颗粒细胞与卵母细胞间相互作用及体外培养环境等。迄今为止，为了提高牛卵母细胞的体外发育能力，许多学者模拟卵母细胞体内环境发展了一些新的体外成熟技术，诸如体外延迟自发恢复减数分裂成熟、外源卵母细胞分泌因子促进卵母细胞体外成熟及模拟生理条件下卵母细胞成熟等方法。本文综述了牛卵母细胞成熟过程、影响卵母细胞体外成熟因素及近年来提高牛卵母细胞体外成熟的新方法。

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15. 绵羊YAP1基因全长cDNA克隆及生物信息学分析

孙伟, 李达, 苏锐, 马月辉, 关伟军, 张有法, 陈玲, 吴文忠, 周洪

2013, 46 (8): 1725-1735. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.08.023

摘要（547）

PDF （945KB）（940）

【目的】克隆绵羊YAP1基因cDNA并分析其序列及其蛋白的遗传特性及其在不同组织中不同程度的表达情况。【方法】以湖羊为研究对象，利用RT-PCR和RACE技术获得绵羊YAP1序列，并结合生物信息学方法对绵羊YAP1的序列进行深入分析。【结果】从湖羊背最长肌中克隆YAP1基因的全长cDNA序列；利用生物信息学技术，对绵羊YAP1基因与其它物种的同源性，蛋白质序列的跨膜区，亚细胞定位，亲水性，潜在信号肽剪切位点，糖基化位点，磷酸化位点，编码产物进行功能预测分析，及其编码蛋白的二级结构，三级结构等进行分析。【结论】克隆获得绵羊YAP1基因序列全长为1 712 bp，包括1 212 bp的编码区序列，编码403个氨基酸。同源性分析发现，绵羊YAP1核苷酸序列与推测氨基酸序列与灰仓鼠的同源性最高，分别达到78.77%和92.51%，而与人、黑猩猩的一致性差异较小。氨基酸序列分析发现该基因编码蛋白为水溶性蛋白，相对分子量为44079.0Da，理论等电点为4.91，无信号肽序列和跨膜区；亚细胞定位主要在细胞核，不属于分泌蛋白；预测含有33个磷酸化位点，7个糖基化位点，具有两个WW结构域，二级结构以无规则卷曲为主，三级结构显示，YAP1结构域区构成弯曲状螺旋结构。预测YAP1蛋白主要在调节功能过程中有着关键作用。以上研究为进一步探讨YAP1基因在肌肉生长过程中的功能研究奠定了遗传信息基础。

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16. 禽源奇异变形杆菌超广谱β-内酰胺酶基因的分子特征

潘玉善, 苑丽, 吴华, 刘建华, 刘珍珍, 赵宜双, 胡功政

2013, 46 (7): 1463-1469. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.07.017

摘要（567）

PDF （703KB）（764）

【目的】研究禽源奇异变形杆菌携带超广谱β-内胺酰酶基因的亚型和blaCTX-M基因的上下游环境。【方法】对分离、鉴定的奇异变形杆菌进行药物敏感性试验、ESBLs产酶确证试验、耐药基因检测和接合试验；利用PCR定位技术（PCR mapping）分析blaCTX-M的基因环境。【结果】ESBLs确证试验表明，21株禽源奇异变形杆菌有10株是阳性表型。PCR扩增和测序结果表明，最常见的ESBL基因是blaCTX-M-14 (n=6) , blaOXA-1 (n=6), 其次是blaCTX-M-65 (n=4)，同时也检测到了blaOXA-10 (n=1)，没有检测到blaSHV。序列分析表明，禽源奇异变形杆菌携带blaCTX-M的上游普遍存在ISEcp1B，下游均为IS903D。【结论】首次在禽源奇异变形杆菌中检测到了blaCTX-M-65，CTX-M型超广谱β-内酰胺酶基因在禽源奇异变形杆菌中已不在少见。

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17. 维生素D3对鹅生长性能、屠宰性能、胴体品质和胫骨发育的影响

王迪, 王宝维, 葛文华, 张名爱, 岳斌, 陈苗璐, 王姣, 孟苓凤

2013, 46 (7): 1470-1480. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.07.018

摘要（765）

PDF （928KB）（853）

【目的】通过在0—15周龄鹅饲粮中添加不同水平维生素D3，探讨其对鹅生产性能、胴体品质和胫骨发育的影响；【方法】试验选择1日龄肝用型青农灰鹅360只，随机分为6个处理，每个处理6个重复，每个重复10只。维生素D3在基础饲粮中添加量分别为：0(对照组)、200、400、800、1600、3 200 IU•kg-1；试验期为15周，记录其采食量、体重和健康状况，计算生产性能；4周龄末和15周龄末分别从每重复抽取1只和2只试验鹅屠宰，测定其屠宰性能、胴体品质和胫骨指标。【结果】（1）饲粮中未添加维生素D3的对照组软骨症发生率为：0—4周36.67%，5—15周26.67%，明显高于试验组；维生素D3添加量3 200 IU•kg-1无临床中毒症状。（2）与对照组相比，饲粮添加400 IU•kg-1维生素D3可显著提高0—4周龄鹅日采食量和日增重(P＜0.05)，维生素D3的添加可显著提高5—15周鹅日增重(P＜0.05)，但添加组组间差异不显著。（3）饲粮中添加800 IU•kg-1维生素D3可极显著提高15周龄鹅的屠宰率(P＜0.01)，显著提高半净膛率(P＜0.05)；添加维生素D3对胸肌肉色有显著影响(P＜0.05)。（4）提高饲粮维生素D3水平可显著提高4周龄鹅胫骨的密度、重量及钙磷含量和15周龄胫骨密度、重量和灰分含量(P＜0.05)；【结论】（1）添加维生素D3对鹅的生产性能、屠宰性能、肌肉品质和胫骨发育具有重要调控作用；饲粮中不添加维生素D3鹅的软骨症发生率明显增加。（2）鹅饲粮维生素D3最适添加量为：0—4周471.70 IU•kg-1，5—15周548.63 IU•kg-1。

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18. 猪类胚胎生殖细胞体外诱导分化为神经细胞的研究

丛义梅, 马婧, 孙瑞珍, 王健宇, 薛冰华, 胡魁, 尹智, 刘忠华

2013, 46 (6): 1272-1279. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.06.022

摘要（659）

PDF （894KB）（768）

【目的】探讨猪类胚胎生殖细胞向神经细胞分化的潜能。【方法】采用性腺-中肾区基质细胞与猪原始生殖细胞共培养的方法得到猪类胚胎生殖细胞，通过直接分化的方法进行神经细胞定向诱导。【结果】（1）与小鼠成纤维细胞作为饲养层相比，性腺-中肾区基质细胞作为饲养层同样能够支持猪类胚胎生殖细胞生长，二者对猪类胚胎生殖细胞的增殖能力不存在显著影响；（2）猪类胚胎生殖细胞有较强的碱性磷酸酶活性，Q-PCR结果显示多能性基因Oct4、Sox2及Nanog表达，增殖能力呈现“S”型，即生长的潜伏期、对数期及平台期，猪类胚胎生殖细胞经体外悬浮培养能够形成拟胚体；（3）经过诱导猪类胚胎生殖细胞能够分化形成表达神经干细胞、神经元及神经胶质细胞标记物的多种神经细胞类型。【结论】从早期性腺中成功分离培养得到了猪类胚胎生殖细胞，通过简单、快速的神经细胞分化的诱导体系证实了猪类胚胎生殖细胞具有体外定向分化为多种神经谱系细胞的能力。

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19. 中国西部天然草地疯草生态及动物疯草中毒研究与防控现状

周启武, 赵宝玉, 路浩, 王姗姗, 张樑, 温伟利, 杨晓雯

2013, 46 (6): 1280-1296. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.06.023

摘要（791）

PDF （1054KB）（990）

西部天然草地是中国草地畜牧业的重要生产基地，也是其重要的绿色生态屏障，对维护生态安全和食物安全，保护人类生存环境，实现草地永续利用，具有重要战略意义。长期以来，由于草地干旱、超载过牧、盲目开垦等自然和人为因素的影响，以及草地基础建设投入不足和管理滞后，导致草地大面积沙化和毒草化。特别是近几十年来，草地毒害草的迅速蔓延，造成草地植被群落和生物多样性减少，草地植被单一，沙漠化等生态学问题，严重影响了草地生态平衡以及牧区畜牧业的可持续发展。“疯草”已成为西部天然草地主要毒害草之首，每年给畜牧业造成直接经济损失超过几十亿元。本文就中国西部天然草地疯草研究历史、种类与生态分布、毒性灾害状况、毒性成分与毒性机理、灾害及综合防控技术进行综述，并提出今后疯草研究中应注意的问题，对认识疯草在天然草地中的生态作用和疯草灾害综合防控具有重要指导意义。

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20. 三群商品代蛋鸡J亚群白血病跟踪观察

边晓明, 李德庆, 赵鹏, 崔治中

2013, 46 (2): 409-416. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.02.020

摘要（484）

PDF （860KB）（539）

【目的】了解J亚群白血病在海兰褐蛋鸡群中发生和发展的真实表现及其与病毒分离和抗体反应的关系；【方法】对来自3个鸡场39至43周龄31只疑似ALV-J感染鸡做了连续两个月的临床、病理、病毒血症和抗体反应动态观察和比较；【结果】这3群鸡对ALV-J感染率非常高，有28只鸡在死前感染ALV-J或呈现持续性病毒血症，其中14只表现为无抗体反应的免疫耐受性持续性病毒血症。这3群鸡都表现为典型J亚群白血病髓细胞样肿瘤特征性病变，且在几乎所有不同脏器和组织均可出现。在31只鸡中，有13只鸡同时在3个或3个以上不同脏器中出现肿瘤/血管瘤，有1只鸡出现在5个器官中；【结论】中国近年来不仅仍有ALV-J在蛋鸡群中流行，而且在过程中，ALV-J致病性逐渐增强。

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21. 分泌抗春雷霉素单克隆杂交瘤细胞株的建立及免疫学特性鉴定

龚芳, 职爱民, 李青梅, 胡骁飞, 赵启发, 张小辉, 陆启玉, 张改平

2013, 46 (2): 417-423. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.02.021

摘要（662）

PDF （531KB）（786）

【目的】制备高灵敏、高特异性的抗春雷霉素单克隆抗体，并对其免疫学特性进行鉴定。【方法】采用EDC法将KSM分别偶联于载体蛋白BSA和OVA上，分别合成免疫原KSM-BSA和包被原KSM-OVA，经SDS-PAGE鉴定后，免疫Balb/c小鼠，免疫间隔4周，4次免疫后，利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性，选出效价高、敏感性好的小鼠进行细胞融合，经过多次亚克隆筛选出分泌高敏感的特异性抗KSM单克隆抗体的杂交瘤细胞株，体内诱生腹水法制备抗KSM的单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。【结果】SDS-PAGE鉴定结果显示KSM-BSA成功偶联，间接ELISA检测显示免疫的6只小鼠血清效价均达1:104以上，其中3号小鼠多抗血清敏感性最好，半数抑制浓度IC50为73.9ng•mL-1，融合后筛选出两株杂交瘤细胞株1G7和2C8，亚型均为IgG1型，其细胞上清效价分别为1:5.12×103 和1:1.28×103，腹水效价分别为1:5.12×105和1:2.56×105，抗KSM的单克隆抗体对春雷霉素的IC50为8.902ng•mL-1，与其它竞争物的交叉率均小于0.03%。【结论】本试验成功合成了春雷霉素人工抗原，并制备了敏感性高、特异性好的单克隆抗体，为春雷霉素免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。

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22. 荧光定量PCR作为猪瘟兔化弱毒疫苗效价检验替代方法的研究与应用

陈锴, 姚华伟, 王长江, 徐璐, 范学政, 赵启祖, 邹兴启, 朱元源, 赵燕, 杨光友, 王琴

2013, 46 (1): 162-169. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.01.019

摘要（746）

PDF （609KB）（636）

【目的】建立一种快速、敏感、特异的检测猪瘟兔化弱毒疫苗（HCLV）的荧光定量PCR方法(FQ-PCR)，为猪瘟兔化弱毒疫苗的效力检验提供一替代方法。【方法】在猪瘟兔化弱毒疫苗基因组3′非编码区设计一对针对猪瘟兔化弱毒株的特异性引物和一条MGB探针，并进行反应体系及反应条件优化，以及特异性、灵敏度、稳定性及符合性试验。将此方法用于部分批次疫苗厂疫苗半成品的定量检验，与兔热反应进行比较，寻求两方法的相关性。【结果】试验结果证实，CT值与模板之间呈现良好的相关性，相关系数为0.9998，扩增效率为101.14%；该方法仅扩增HCLV，不扩增HCLV以外的其它病原，显示良好的特异性；具有较高的灵敏度，能检测模板中4.35个cDNA拷贝量，比CSFV-RT-nPCR高1个数量级。将此方法应用于4个厂家17个批次的34份猪瘟兔化弱毒疫苗效力检验，两只兔子均无热反应（不合格）样品共11份，FQ-PCR CT值为21.15—27.30；两只兔子一只呈现定型热，一只无热反应的样品12份，CT值为17.47—23.70；两只兔子都呈现定型热或者一只呈现定型热一只呈现轻热反应（合格品）样品共11份，CT值为17.10—20.8。【结论】建立的HCLV-FQ-PCR方法能特异性的检测疫苗核酸含量，与家兔热反应测定结果存在良好的相关性，可以用于猪瘟疫苗半成品中HCLV定量检测。

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23. 转录靶向猪Jiv基因shRNA细胞株的建立及抗猪瘟病毒转基因猪的构建

郭抗抗, 雷安民, 宁蓬勃, 程敏, 何雷, 刘伟, 谭学超, 徐磊, 曹伟伟, 张彦明

2013, 46 (1): 170-178. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.01.020

摘要（558）

PDF （782KB）（613）

【目的】构建转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的阳性细胞株，通过比较各细胞株对猪瘟病毒增殖的干扰效果，筛选对猪瘟病毒增殖有明显抑制作用的细胞株，为抗猪瘟转基因猪的构建提供材料。【方法】研究设计了靶向猪Jiv基因的4个shRNA干扰片段，并构建插入干扰片段的慢病毒(P1、P2、P3、P4)。将慢病毒分别转染PK-15细胞，阳性细胞接种猪瘟病毒后72 h用实时荧光定量PCR检测猪瘟病毒RNA的量，以比较4种干扰细胞株对猪瘟病毒增殖的干扰效果。将对猪瘟病毒增殖有较好干扰效果的P2慢病毒干扰载体转染猪胎儿成纤维细胞，获得稳定表达靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的猪胎儿成纤维细胞株，作为抗猪瘟病毒转基因猪构建的供体细胞，将细胞核移植到成熟的去核猪卵母细胞中，获得体细胞核移植胚胎，移植入受体母猪输卵管中进行转基因猪构建，对获得的转基因猪进行外源基因的鉴定。【结果】获得了4株转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的PK-15细胞株，其中转入P2干扰载体的细胞株对猪瘟病毒的增殖有明显的抑制作用，将转入P2干扰载体的猪胎儿成纤维细胞株为核供体细胞通过体细胞核移植，获得经鉴定为外源基因插入阳性的转基因猪。【结论】细胞Jiv基因的表达对猪瘟病毒的增殖有一定的影响，筛选获得的一个干扰细胞株对猪瘟病毒的增殖有明显的干扰效果；通过体细胞核移植技术获得一头转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段（P2）的转基因猪。

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24. 嵌合猪瘟病毒基因Ⅱ型E2抗原区的重组C株病毒构建及其生物学特性

童超, 陈宁, 廖迅, 袁雪梅, 李肖梁, 方维焕

2013, 46 (1): 179-186. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.01.021

摘要（533）

PDF （589KB）（751）

【目的】目前使用的基因Ⅰ型猪瘟兔化弱毒C株疫苗是公认的安全、有效疫苗，但近年来基因Ⅱ群的猪瘟流行毒株比例增高，因此对猪瘟(CSF)的有效防控提出了更高要求。本研究旨在通过反向遗传学技术构建适应CSFV基因Ⅱ型的新型C株疫苗，为标记疫苗的开发奠定基础。【方法】在构建的C株感染性克隆基础上，拯救嵌合CSFV基因Ⅱ型HZ1-08毒株E2抗原区的重组C株病毒RecCHZE2，并分析其致病性和免疫原性。【结果】重组嵌合病毒RecCHZE2接种家兔后出现典型的定型热，兔脾脏肿大；重组嵌合病毒RecCHZE2接种猪只后没有发热和明显的白细胞减少，在接种后第12天检测到一过性的病毒血症；对接种猪血清检测结果表明，针对2型毒株的相应抗体在接种后的20 d达到高峰；接种猪血清针对C株和HZ1-08毒株的中和抗体效价相当，但C株免疫猪血清对流行毒株的中和抗体水平降低。【结论】重组嵌合病毒RecCHZE2不仅保留C株病毒弱毒的特性，且可提高针对Ⅱ型流行毒株的抗体水平。

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25. 猪瘟病毒石门重组标记毒株的构建与拯救

朱元源, 韩焘, 邹兴启, 范学政, 徐璐, 王琴, 赵启祖

2013, 46 (1): 187-194. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.01.022

摘要（523）

PDF （605KB）（586）

【目的】中国控制猪瘟主要采用疫苗免疫，现有的猪瘟兔化弱毒疫苗有较好的免疫保护效果，但是不能从血清学上区分疫苗免疫猪与自然感染猪，猪瘟标记疫苗的研制与配套检测技术的开发可有效解决这一问题。【方法】利用猪瘟病毒低温诱变弱毒T株感染性克隆，将其全长结构蛋白基因替换为猪瘟病毒石门毒株全长结构蛋白基因，得到猪瘟石门重组病毒的全长感染性克隆pSMT；随后在pSMT E1蛋白的C端插入Flag抗原基因作为鉴别标记，构建猪瘟石门重组标记病毒的感染性克隆pSMT-Flag。经电转染法拯救出两株重组病毒vSMT和vSMT-Flag，通过SK6细胞进行病毒传代以获得重组病毒。【结果】多组酶切鉴定表明两株重组质粒成功构建，PCR扩增及测序、免疫过氧化酶单层细胞试验（IPMA）表明重组病毒已成功拯救且能成功传代。【结论】该标记病毒能够与Flag单抗发生特异性反应，且不影响E2蛋白中和表位与猪瘟单抗的结合，因此该毒株为研制CSFV新型标记疫苗提供了思路。

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26. 信号分子AI-2对禽致病性大肠杆菌的调控作用

白灏, 韩先干, 刘蕾, 单雪芹, 宋军, 刘瑞, 董洪亮, 刘海文, 丁铲, 于圣青

2012, 45 (24): 5110-5116. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.24.017

摘要（509）

PDF （599KB）（601）

【目的】研究信号分子AI-2对禽致病性大肠杆菌（APEC）的调控作用。【方法】采用改良结晶紫半定量法和荧光染色法检测AI-2对APEC生物被膜形成能力的影响。Real-time PCR检测AI-2对APEC毒力基因转录水平的影响。活菌计数法观察AI-2对APEC黏附和入侵鸡胚成纤维细胞DF-1的影响。【结果】AI-2在浓度为0.185 mmol•L-1时，生物被膜形成能力显著增强，而浓度为0.037mmol•L-1和0.285mmol•L-1时，生物被膜形成能力无显著变化。Real-time PCR结果显示加入AI-2后，APEC毒力基因pfs，vat，luxS，tsh，fuyA，iucD转录水平显著下调，ompA和iss则上调。加入AI-2后，APEC对DF-1细胞的黏附和入侵能力分别下降到原来的57.35%和36.64%。【结论】AI-2对禽致病性大肠杆菌生物被膜形成具有浓度依赖性，在适宜浓度下能显著增强。AI-2能减弱禽致病性大肠杆菌毒力基因的转录水平和对DF-1的黏附和入侵能力。表明AI-2参与调控APEC致病性。

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27. 基于遗传算法优化的BP神经网络的组合预测模型方法研究

梁毅, 刘世洪

2012, 45 (23): 4924-4930. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.23.020

摘要（551）

PDF （644KB）（881）

【目的】提出以传统猪瘟发病率为对象的组合预测模型。【方法】利用ARIMA模型以及灰色模型GM(1,1)进行数据初始化处理，将初步处理结果作为优化后的BP神经网络输入构建组合模型。【结果】利用组合模型对2000年到2009年的月度发病数据进行实例分析，结果表明预测数据精度达到97.379%，较ARIMA模型，灰色模型、BP神经网络模型分别提高了5.469%、3.499%、1.188%，模型平稳性增强，预测结果良好。【结论】本研究为动物疫情测报提供了有效的分析手段，验证了组合模型在动物疫情研究中的可行性，并可为其它动物疫病提供借鉴和参考。

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28. 牛源犬新孢子虫NcSAG1基因重组腺病毒株的构建及动物免疫试验

贾立军, 张守发

2012, 45 (22): 4705-4712. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.22.017

摘要（564）

PDF （586KB）（525）

【目的】构建表达牛源犬新孢子虫NcSAG1基因的重组腺病毒株，并接种Balb/c小鼠，评价重组腺病毒株对Balb/c小鼠的体液免疫和细胞免疫应答水平。【方法】PCR扩增牛源犬新孢子虫NcSAG1基因，构建pMD18-T-NcSAG1克隆质粒和pCR259-NcSAG1重组腺病毒穿梭质粒；将鉴定正确的pCR259-NcSAG1重组腺病毒穿梭质粒依次转化HighQ-1 Transpose-Ad 294和HighQ-1™感受态细胞，构建Transpose-Ad-NcSAG1重组腺病毒表达质粒；PacI酶切线性化后，脂质体介导转染QBI-HEK 293细胞包装重组腺病毒Ad5-NcSAG1，应用PCR和Western blotting技术检测Ad5-NcSAG1及其表达蛋白产物。测定Ad5-NcSAG1重组腺病毒滴度后，接种Balb/c小鼠，测定小鼠血清中IgG特异性抗体和细胞因子IFN-γ、IL-4水平，以此评价重组腺病毒株的免疫应答效果。【结果】扩增的牛源犬新孢子虫NcSAG1基因大小为982bp，与GenBank中发表的NcSAG1（AF132217）核苷酸序列的同源性为99.2%；经PCR和Western blotting检测，重组腺病毒Ad5-NcSAG1在QBI-HEK 293细胞中包装成功，表达蛋白的分子量为33kD，具有较好的反应原性；测得重组腺病毒Ad5-NcSAG1滴度为1010TCID50/mL，Ad5-NcSAG1接种Balb/c小鼠后，能够诱导产生高水平的IgG特异性抗体和IFN-γ、IL-4细胞因子。说明Ad5-NcSAG1重组腺病毒对Balb/c小鼠产生了较强的体液免疫和细胞免疫应答。【结论】成功构建了牛源犬新孢子虫NcSAG1基因的重组腺病毒株，该毒株能够诱导Balb/c小鼠产生高水平的体液免疫和细胞免疫应答，为犬新孢子虫新型疫苗的临床试验奠定了基础。

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29. 细粒棘球绦虫成虫表膜糖抗原的免疫性分析

古努尔?吐尔逊, 米晓云, 张壮志, 石保新, 吐尔洪?依米提, 金映红, 张妹, 程小波, 张旭, 赵莉, 张文宝

2012, 45 (22): 4713-4719. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.22.018

摘要（549）

PDF （547KB）（434）

【目的】探索细粒棘球绦虫成虫表膜糖抗原的免疫性。【方法】细粒棘球绦虫成虫虫体冻融产物，经蛋白酶K消化，离心上清作为粗提表膜糖抗原，SDS-PAGE鉴定糖抗原成分，硫酸-蒽酮法测定多糖浓度，ELISA、Western- blot 和IFA法分别检测免疫小鼠抗血清抗体效价和特异性以及确定抗原在虫体组织中的位置。【结果】SDS-PAGE图谱显示无蛋白条带出现，表明成虫膜蛋白被蛋白酶K完全降解；制备的糖抗原浓度为2.54mg•mL-1，初步确定为糖抗原。ELISA结果显示，随着免疫次数增加，抗血清中特异性抗体(IgG 、IgM 和IgA)效价也随之升高。与阴性血清相比，IgG 、IgM 和IgA的P/N值分别为4.9、3.2和6.4。未检测到特异性IgE。Wenstern-blot检测结果显示，抗血清与原头蚴粗提虫体蛋白、细粒棘球绦虫成虫表膜蛋白、表膜糖抗原有效识别。IFA显色结果显示糖抗原在细粒棘球绦虫虫体表膜中有表达。【结论】经蛋白酶K消化后提取的细粒棘球绦虫表膜糖抗原具有良好的的免疫原性和免疫反应性，有望用于包虫病的诊断和免疫。

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30. 坦布苏病毒荧光定量RT-PCR方法的建立

于春梅, 刁有祥, 唐熠, 崔京腾, 高绪慧, 张颖, 鞠小军, 武利利

2012, 45 (21): 4492-4500. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.21.018

摘要（851）

PDF （1405KB）（901）

【目的】利用SYBR GreenⅠ荧光定量技术建立一种相对定量检测坦布苏病毒的方法。【方法】针对坦布苏病毒NS5、E基因分别设计了1对特异性引物，同时设计1对扩增内参基因β-actin引物，将PCR扩增的片段分别连接到pMD18-T载体上构建重组质粒，经筛选、鉴定纯化后，倍比稀释作为质控样品，用于实时荧光定量PCR中NS5、E基因及内参基因β-actin标准曲线的构建，并进行反应的灵敏性、特异性和重复性试验。【结果】结果显示标准曲线线性关系R2值均在0.99 以上, 检测极限约为1.0E+01拷贝数质粒DNA；特异性结果表明只能检测到坦布苏病毒的扩增曲线；批内和批间重复性试验的变异系数均小于0.5%；用已建立的方法对临床样品进行3次重复检测，病毒RNA的检出率为100%。【结论】本研究初步建立了基于坦布苏病毒NS5、E基因的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR的方法，为养鸭场诊断和监测坦布苏病毒提供了一种新的特异、灵敏的检测方法。

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31. 新疆南疆猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学研究

赵丽, 刘永宏, 焦海宏, 张志峰, 刘俊峰, 陈兖州, 温雅琴, 刘博, 李江涛, 崔浩然, 程波, 张春光

2012, 45 (20): 4288-4299. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.20.019

摘要（549）

PDF （835KB）（527）

【目的】确定新疆南疆猪养殖场是否存在PRRSV感染，以及感染的PRRSV毒株类型及基因特点，从而针对性的有效防制PRRS。【方法】设计7对引物，对疑似PRRS发病猪场组织样品进行RT-PCR、克隆、测序和序列分析。【结果】47例样品，35例PRRSV阳性，阳性率高达74.47%（35/47）；35株均为美洲型毒株，其中有10株属于高致病性PRRSV，占总检测样品的21.28%（10/47），占阳性样品的28.57%（10/35）；综合分析本研究采集样品猪养殖场不存在欧洲型毒株。【结论】新疆南疆存在美洲型PRRSV感染，且存在高致病性毒株。

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32. 基于环形泰勒虫Tams1基因多态性的二温式-PCR检测方法的建立

罗金, 刘光远, 田占成, 谢俊仁

2012, 45 (20): 4300-4309. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.20.020

摘要（524）

PDF （529KB）（841）

【目的】环形泰勒虫作为牛科动物重要的血液原虫对养牛业产生了重大危害。近年来针对该病原Tams1基因的诊断方法及候选疫苗筛选进行了大量工作。但研究证明该基因多态性对诊断及免疫效果存在影响。基于此，本研究对Tams1基因多态性特征进行了分析，并为该病的诊断建立一种实施有效的检测方法。【方法】参考GenBank中公布的环形泰勒虫Tams1 基因的核苷酸序列，设计特异性引物。PCR扩增，获得了846 bp的核苷酸片段。将该基因片段与GenBank中主要的12种已知不同区域虫株的相应氨基酸序列进行比较分析。在保守区设计引物，以Tams1基因标准阳性质粒为模板建立环形泰勒虫病的二温式-PCR检测方法。经优化的方法用于田间样品的检测。【结果】该基因编码281个氨基酸，碱性氨基酸48个，酸性氨基酸42个，疏水性氨基酸100个。系统发生树结果显示，环形泰勒虫甘肃株与安哥拉、土耳其、巴林地方株亲缘关系较近。新疆株与意大利、西班牙地方株关系较近，而与甘肃株亲缘关系相对较远。这一结果通过环形泰勒虫不同国家地方株的氨基酸序列对齐结果可以得到进一步的说明。建立的二温式-PCR检测方法，可检测到0.31 fg•μL-1血液中感染虫体的量。特异性结果表明，仅有环形泰勒虫基因组DNA检测为阳性，其它对照虫种基因组模板均表现为阴性，且与感染牛的其它梨形虫无交叉反应。本实验建立的环形泰勒虫二温式-PCR方法对收集的335份野外样品进行检测，阳性检出率为16.33%，显微镜检测阳性率为2.25%，两者符合率100%。与普通PCR比较，二温式-PCR在敏感性方面没有显著差异，但其特异性更高，且该方法反复升温降温时间消耗短。【结论】环形泰勒虫Tams1基因不同地方株存在明显的差异。其氨基酸序列的多态性特征差异显著。因此该基因作为潜在候选抗原应注重多肽疫苗的设计。二温式-PCR方法具有的良好敏感性和特异性，对环形泰勒虫病的流行可以起到提前检测的效果，提高了疾病的诊断效率。

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33. NSP4基因突变的重组牛轮状病毒的拯救及其鉴定

杨少华, 何洪彬, 杨宏军, 陈方园, 高运东, 仲跻峰

2012, 45 (19): 4102-4108. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.19.023

摘要（818）

PDF （548KB）（730）

【目的】通过反向遗传技术结合RNAi筛选和蚀斑克隆方法，拯救出毒力减弱的轮状病毒(rotavirus, RV)。【方法】以野生型轮状病毒CHLY基因组RNA为模板，通过重叠PCR方法在NSP4基因93—104 nt引入5个沉默突变核苷酸，并将毒力位点区135aa、136aa和138aa对应的核苷酸进行定向突变，构建了含有突变位点的转录质粒△pT7-NSP4/89/M。将该质粒与携带RNA聚合酶基因的重组质粒pcDNA3.1/T7-RNAP共转染已接种野生型RV病毒的MA104细胞单层，继续培养24 h，获得了携带NSP4变异基因的RV病毒粒子和野生型RV病毒粒子的混合病毒。将获得的混合病毒接种MA104细胞，通过RNA干扰和蚀斑克隆方法逐步筛选纯化以获得拯救RV。【结果】成功拯救出了NSP4基因变异的RV，该病毒在MA104细胞上的病变和致乳鼠腹泻效果较野生型RV明显减弱。【结论】通过反向遗传技术结合RNAi筛选和蚀斑克隆方法成功拯救出毒力减弱的RV；NSP4毒力位点135aa、136aa和138aa的变异对RV毒力改变和腹泻严重程度有影响。

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34. 高致病性PRRSV与PCV2共感染协同致病性研究

范培虎, 危艳武, 郭龙军, 吴洪丽, 黄立平, 刘长明

2012, 45 (18): 3859-3872. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.18.019

摘要（689）

PDF （18990KB）（262）

【目的】为阐明高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）和猪圆环病毒2型（PCV2）的协同致病作用，澄清两种病毒不同时间顺序共感染与其协同致病力之间的关系。【方法】选取35日龄阴性健康猪30头，随机分6组，PCV2/HP-PRRSV顺序共感染组、HP-PRRSV/PCV2顺序共感染组、HP-PRRSV+PCV2同时共感染组、HP-PRRSV感染组、PCV2感染组、未接种对照组。感染后每天测量体温、观察临床症状，每周称量体重、采血。用流式细胞仪检测血液中的CD3+ CD4+ CD8-、CD3+ CD4- CD8+、γδT、NK细胞及粒细胞和单核细胞变化；免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）检测这两种病毒抗体变化；用ELISA法检测血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-2、GM-CSF细胞因子变化；用荧光定量PCR法检测血清和组织中病毒载量。对各组试验猪进行组织病理学观察。【结果】HP-PRRSV/PCV2顺序共感染组临床症状最严重，死亡率达60%；组织和血清中病毒载量显著高于其它组，抗体滴度明显低于其它组；淋巴细胞亚群及细胞因子（尤以TNF-α）变化也最为明显。【结论】HP-PRRSV和PCV2之间存在协同致病作用，且猪群先感染HP-PRRSV后感染PCV2可明显提高猪群发病率和死亡率。本研究对临床HP-PRRSV和PCV2的综合防制提供科学依据。

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35. 鸭β-防御素16的分离、鉴定及其抗病毒机制

张可心, 张名岳, 辛胜男, 韩宗玺, 邵昱昊, 刘胜旺, 马得莹

2012, 45 (18): 3873-3882. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.18.020

摘要（790）

PDF （433KB）（461）

【研究目的】旨在克隆与表达鸭β-防御素16（AvBD16）基因及测定其生物学特性，监测了鸭肝炎病毒感染后麻鸭不同组织AvBD16与TLR-7的动态变化。【方法】采用RT-PCR方法，从鸭骨髓组织中扩增到鸭AvBD16，并将该基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1 上进行原核表达，对其重组和合成蛋白进行生物学活性测定。采用荧光定量PCR方法，分别检测了鸭肝炎病毒对鸭AvBD16和TLR-7在不同组织中表达量的影响。【结果】鸭AvBD16 cDNA 大小为155bp，编码50个氨基酸残基，与鸡AvBD3氨基酸同源性最高，为62%。重组和合成鸭AvBD16蛋白对12种细菌均有不同程度的抑制作用，高盐浓度对其抗菌活性有一定影响，且溶血活性极低。重组AvBD16蛋白具有体外抗病毒活性。经鸭肝炎病毒诱导后，鸭AvBD16在肝脏及其他组织中被诱导表达或表达量显著上调，且与TLR7的表达量呈正相关。【结论】成功克隆并表达了鸭AvBD16基因，重组和合成AvBD16蛋白具有广谱的抗菌活性且不具有溶血特性。重组AvBD16蛋白具有抗鸭肝炎病毒的活性，体内抗病毒作用可能受TLR-7通路调节。

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36. 牛源金黄色葡萄球菌的耐药性及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测

苏洋., 蒲万霞, 陈智华, 邓海平

2012, 45 (17): 3602-3607. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.17.017

摘要（645）

PDF （405KB）（574）

【目的】了解内蒙古地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌耐药性和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染的情况，为奶牛乳房炎的防治提供理论依据。【方法】采用K-B纸片扩散法，检测分离自内蒙古地区38株金黄色葡萄球菌对17种药物的敏感性，同时用琼脂稀释法检测苯唑西林、万古霉素对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）；再用头孢西丁、苯唑西林纸片扩散法、苯唑西林盐琼脂筛选法和PCR方法扩增mecA耐药基因对分离菌株进行全面MRSA检测。【结果】分离菌株对每种抗生素都有不同程度抗性，对氨苄西林、头孢拉丁、青霉素、复方新诺明、新生霉素和链霉素的耐药率都高于45%，而对氧氟沙星、丁胺卡那霉素、万古霉素、环丙沙星、庆大霉素和头孢唑林的敏感性高于90%，2株细菌的万古霉素MIC≥16 μg•mL-1；其中8株细菌的苯唑西林MIC≥8 μg•mL-1，而其它菌株的苯唑西林MIC≤2 μg•mL-1；分离菌株多重耐药情况严重，耐受3种及3种以上药物的菌株占84.21%，其中4株细菌能同时耐受9种不同抗菌药物；16（42.11%）株细菌被检测携带mecA耐药基因，而仅有其中7株的苯唑西林MIC≥4 μg•mL-1；头孢西丁、苯唑西林纸片扩散法和苯唑西林盐琼脂筛选法分别检出7株、10株和7株表型为MRSA的菌株。【结论】分离菌株的耐药性和多重耐药现象较为严重，被调查地区奶牛场中已经存在MRSA和OS-MRSA感染情况，且感染率高。

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37. 中国部分地区猪源和牛源金黄色葡萄球菌耐药性及凝固酶分型研究

刘洋, 梁耀峰, 焦新安, 宋立, 张纯萍, 宁宜宝, 徐士新

2012, 45 (17): 3608-3616. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.17.018

摘要（694）

PDF （469KB）（664）

【目的】了解中国动物源金黄色葡萄球菌的耐药现状，以及凝固酶血清型和基因型分布情况，为控制动物源金黄色葡萄球菌的传播和流行提供理论依据。【方法】用微量肉汤稀释法测定细菌耐药性；用凝固酶分型血清确定血清型别；扩增凝固酶基因（coa）并进行序列测定，用mega软件进行序列分析。【结果】共鉴定出124株金黄色葡萄球菌。耐药性检测结果表明，在13种测试抗菌药中，金黄色葡萄球菌对氨苄西林和青霉素的耐药率最高，接近100%，其次是红霉素75%，其它10种药物的耐药率在50%以下，头孢西丁耐药率27%，未发现万古霉素耐药菌株；凝固酶血清分型率达91%，共分出6个型，VII型，VI型和复合型占优势，未分离到Ⅲ型和Ⅴ型；扩增凝固酶基因，共分为6个基因型；构建了凝固酶基因的系统进化树。【结论】中国动物源金黄色葡萄球菌的耐药状况比较严重，猪源菌株的耐药率要高于牛源菌株。凝固酶血清型别多样，分布相对较集中，具有独特的流行特征；凝固酶表型与其基因的进化特征并没有出现直接对应关系，但为进一步开展兽医临床金黄色葡萄球菌分子流行病学调查研究奠定了理论基础。

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38. 布鲁氏菌外膜蛋白BP26细胞毒性作用的研究

陈瑞花, 张辉, 唐利燕, 孟茹, 张豫, 王震, 李志强, 张俊波, 陈创夫

2012, 45 (16): 3406-3413. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.16.021

摘要（722）

PDF （642KB）（764）

【目的】布鲁氏菌外膜蛋白BP26是布鲁氏菌的重要毒力因子，本研究采用bp26基因缺失株和BP26蛋白分别与胚胎滋养层细胞(HPT-8)作用，探讨布鲁氏菌bp26基因的生物学功能。【方法】采用Ni柱亲和层析法纯化BP26蛋白，overlap技术构建布鲁氏菌bp26基因缺失株，用BP26蛋白和bp26基因缺失株分别侵染HPT-8细胞，观察细胞形态变化，ELISA检测上清中的细胞因子。【结果】从布鲁氏菌疫苗株M5-90克隆出bp26基因并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中成功表达，获得纯化的BP26蛋白，经SDS-PAGE验证正确，Western-Blot鉴定具有免疫原性。将目的片段bp26基因的上下臂插入到自杀载体pGEM-7zf中，电转至布鲁氏菌疫苗株M5-90感受态细胞中，成功筛选出了具有遗传稳定性的bp26基因缺失株。用BP26蛋白与bp26基因缺失株分别侵染HPT-8层细胞，BP26蛋白使细胞变形且贴壁不牢，缺失株导致细胞大量脱落溶解，ELISA检测蛋白侵染HPT-8细胞诱导产生的细胞因子IL-6、TNF-α和LDH均高于PBS对照组，差异极显著（P＜0.01）, 而细胞因子IL-10的分泌下降。缺失株侵染HPT-8细胞诱导产生的细胞因子IL-6、TNF-α均高于M5-90对照组，LDH和IL-10均低于M5-90对照组，差异显著（P＜0.05）。【结论】成功获得了布鲁氏菌BP26蛋白和M5-90Δbp26缺失株，BP26蛋白可以引起HPT-8细胞的炎性反应，有细胞毒性作用，bp26基因缺失株对HPT-8细胞有损伤作用，bp26基因在布鲁氏菌侵染宿主细胞过程中起重要作用。

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39. Mmu-miR-34c慢病毒表达载体构建及在奶山羊雄性生殖干细胞的表达

刘超, 于萌, 朱海鲸, 李明昭, 华进联

2012, 45 (16): 3414-3421. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.16.022

摘要（644）

PDF （1261KB）（917）

【目的】用两种方法构建miR-34c的慢病毒表达载体，并包装成慢病毒颗粒，为经济、高效的进行miR-34c超表达提供方案，为进一步研究miR-34c的作用奠定基础。【方法】从小鼠基因组中扩增miR-34c前体，分别插入pLL3.7的CMV启动子起始的GFP之后或U6启动子后，构建成载体pLL3.7-CMV-34c及pLL3.7-U6-34c。将重组慢病毒载体和包装质粒混合物转染包装细胞293T细胞，包装产生慢病毒颗粒，测定病毒滴度。感染293T细胞与关中奶山羊雄性生殖干细胞，用293T细胞与奶山羊雄性生殖干细胞的GFP表达程度测定转染效率，用定量PCR方法测定miR-34c的表达效率。【结果】重组质粒酶切及PCR分析及转化菌液测序，证明插入序列正确，qPCR检测显示：miR-34c的表达在慢病毒载体感染的293T细胞与关中奶山羊雄性生殖干细胞均显著上调。【结论】用 pLL3.7慢病毒载体中的CMV和U6两种启动子均可经济高效地进行miR-34c超表达，且由U6启动子启动的miR-34c慢病毒表达载体可以成功高效感染关中奶山羊雄性生殖干细胞。

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40. 中国部分地区羊泰勒虫病的流行病学调查及分类鉴定

李有全, 彭欲率, 刘志杰, 关贵全, 杨吉飞, 陈泽, 牛庆丽, 罗建勋, 殷宏

2012, 45 (16): 3422-3429. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.16.023

摘要（684）

PDF （628KB）（883）

【目的】调查近年来中国羊泰勒虫病的流行现状，并对其分离株进行分子分类学鉴定。【方法】对分离自2005—2011年间的羊血液基因组以及蜱基因组，依次用吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和绵羊泰勒虫特异引物进行PCR扩增。对阳性样品进行18S rRNA基因的特异扩增和测序分析，并建立系统发育树。【结果】对所有羊血液基因组和蜱基因组的PCR扩增表明，在中国所调查的4省9县市，羊泰勒虫病的流行存在明显差异。甘肃省羊泰勒虫病的发病率和感染率较高，主要呈吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫混合感染，现场调查危害比较严重。新疆喀什仅存在绵羊泰勒虫，调查没有见到临床发病病例。在湖北样品中检测到吕氏泰勒虫，但未发现临床上发病病例。在云南样品中没有检测到羊泰勒虫及其发病病例。【结论】羊泰勒虫病在中国上述区域呈现不同程度的发病率和感染率，该研究为这些区域羊泰勒虫病的综合防治提供了参考依据。

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