%A 曹可可,刘宁,马双新,曹志艳,梁东旭,柴江婷,董金皋 %T 大斑刚毛座腔菌高产漆酶条件的响应面优化及酶学特性 %0 Journal Article %D 2015 %J 中国农业科学 %R 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.11.008 %P 2165-2175 %V 48 %N 11 %U {https://www.chinaagrisci.com/CN/abstract/article_18787.shtml} %8 2015-06-01 %X 【目的】优化大斑刚毛座腔菌(Setosphaeria turcica)高产漆酶的最佳发酵条件,确定其酶学性质,为进一步开发应用奠定基础。【方法】以大斑刚毛座腔菌为出发菌株,首先采用单因素试验确定影响菌株产漆酶的碳源、氮源及铜离子的种类及范围,并在单因素试验的基础上,以漆酶酶活力为响应值,采用central composite design(CCD)响应面设计试验,利用Design Expert软件对响应值进行3因素3水平下的多元二次回归拟合分析,优化大斑刚毛座腔菌产漆酶的发酵培养基成分;初步分离大斑刚毛座腔菌发酵液中的漆酶,以ABTS为反应底物,设置不同温度及pH,测定漆酶的最适反应温度、pH及热稳定性、pH稳定性,进一步测定其反应动力学常数Km值、Vm值,确定其酶学特性。【结果】建立了以漆酶酶活力为响应值的多元二次回归模型,模型差异显著(P=0.0001),可以用该模型来拟合试验;响应面分析结果表明,各因素对漆酶活力的影响大小依次为Cu2+>葡萄糖>尿素,而葡萄糖和尿素交互作用极显著;通过拟合求出模型极值点,对应的大斑刚毛座腔菌产漆酶的最佳培养条件为:葡萄糖50.05 g?L-1,KH2PO4 1 g?L-1,尿素1.46 g?L-1,MgSO4 0.5 g?L-1,蛋白胨2 g?L-1,玉米浆0.5 g?L-1,CuSO4 0.07 g?L-1,Tween80 3 mL?L-1,28℃,150 r/min振荡培养7 d;在此条件下漆酶活力最高达(40.00±1.20)U?mL-1。对大斑刚毛座腔菌漆酶发酵液初步分离,经SDS-PAGE检测其漆酶相对分子量约为80 kD;以ABTS为底物时,最适反应温度为50℃,最适pH为4.2,在温度较高且弱酸性条件下活性较高,并且具有良好的温度稳定性和pH稳定性,常温下pH为4.2保持14 h后酶活力基本不变,50℃保温14 h后漆酶活力仍保持在60%以上;进一步在常温、pH为4.2时测定其米氏常数Km值为0.036 mmol?·L-1,最大反应速率Vm为28.63 mmol?L-1?min-1。【结论】利用大斑刚毛座腔菌液体发酵产漆酶并研究其酶学特性,表明作为玉米致病菌的大斑刚毛座腔菌产漆酶具有发酵周期短、活性高、稳定性好等特性,可进一步研究开发应用。