%A 董飞, 祭芳, 吴季荣, 殷宪超, 徐剑宏, 史建荣 %T 单端孢酶烯3-O-乙酰转移酶编码基因Tri101的 原核表达及多克隆抗体制备 %0 Journal Article %D 2013 %J 中国农业科学 %R 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.16.007 %P 3369-3376 %V 46 %N 16 %U {https://www.chinaagrisci.com/CN/abstract/article_17746.shtml} %8 2013-08-15 %X 【目的】克隆Tri101并通过原核表达获得纯化蛋白,通过免疫SPF大白兔获得高效价、高灵敏度的多克隆抗体,为Tri101蛋白及转Tri101作物的检测提供抗体基础。【方法】以禾谷镰刀菌(Fusarium graminearium)F3210为材料,PCR法获得Tri101并连接至表达载体pET29a(+),将重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)后利用IPTG进行诱导表达。利用纯化表达产物制备多克隆抗体。【结果】SDS-PAGE分析结果表明,Tri101在大肠杆菌BL21(DE3)中得到表达,重组蛋白大小为50 kD左右,以包涵体形式存在。利用HisTrap亲和柱纯化重组蛋白,最佳咪唑洗脱浓度为200 mmol•L-1。采用烟草蚀纹病毒蛋白酶切除重组蛋白中的His标签,酶切产物经HisTrap亲和柱再次纯化后免疫SPF大白兔,制备多克隆抗体。经ELISA法检测抗体效价为1﹕12 000,检测灵敏度为0.05×10-6 µg•mL-1。Western blotting结果证明制备的多克隆抗体对Tri101具有较好的专一性。【结论】通过Tri101的克隆及原核表达,获得了纯化的融合蛋白,通过免疫动物制备了兔源多克隆抗体,可用于Tri101蛋白及转Tri101小麦的检测。