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陈玉梅1,张聪聪1,胡丽蓉2,房浩1,窦金焕3,郭刚4,王炎4,刘巧香5,王雅春2,徐青1*
CHEN YuMei1, ZHANG CongCong1, HU LiRong2, FANG Hao1, DOU JinHuan3, GUO Gang4, WANG Yan4, LIU QiaoXiang5, WANG YaChun2, XU Qing1* #br#
摘要: 【目的】热应激严重影响奶牛的生产和健康,是制约奶业持续健康发展的重要因素。DNA甲基化作为一种重要的表观遗传调控机制参与动物的热应激反应,但其在奶牛热应激过程中的作用和分子机制研究较少。研究通过检测奶牛热应激相关的DNA甲基化变化,筛选和验证DNA甲基化相关的关键基因,为奶牛热应激的表观遗传机制研究积累数据。【方法】以北京市三元绿荷金银岛牧场的24头中国荷斯坦牛 (泌乳阶段及胎次相同) 为研究对象,分别于春季 (非应激期,2017年4月份) 和夏季 (热应激期,2017年7月份) 采集试验个体的血液,提取DNA,共获得48份DNA样本。首先,随机选择其中15头奶牛,并随机分为3组,每组5份DNA样本混合,通过全基因组重亚硫酸盐测序法 (Whole-genome bisulfite sequencing, WGBS) 检测奶牛基因组DNA的甲基化状态,筛选差异甲基化区域 (Differential methylation region, DMR; 1000 bp windows, 500 bp overlap, P<0.05) 及相关基因,利用PROMO和Methprimer软件预测基因启动子的转录因子结合位点和CpG岛区。然后,39 ℃热处理牛乳腺上皮细胞 (Bovine mammary gland epithelial cells, Mac-T) 不同时间 (24 h, 48 h, 72 h),MTT法检测细胞活力。最后,利用亚硫酸盐测序法 (Bisulfite sequencing PCR, BSP) 分别对春夏季的24头奶牛及39 ℃热处理不同时间的Mac-T细胞中目的基因启动子区的甲基化状态进行分析。【结果】通过WGBS共得到49 861个DMRs,其中一个DMR注释到基因GNAS复合体基因座 (GNAS complex locus, GNAS) 的启动子区,其整体甲基化水平在夏季热应激期极显著上调 (P<0.001),且该区域预测到一个352bp的CpG岛,包含Sp1、C/EBP等重要转录因子的结合区域。24头奶牛个体中GNAS基因启动子区31个CG位点的整体甲基化水平在热应激期显著上调 (P<0.05),与WGBS结果一致,其中,21号 (-113 bp,Chr13:57532733) 和27号CG (-63 bp,Chr13:57532683) 位点甲基化水平显著上调 (P<0.05)。Mac-T 细胞热处理48 h和72 h后,细胞活力极显著下降 (P<0.01),GNAS基因启动子的CG 位点整体甲基化水平显著上调 (P<0.05),21号和27号CG均为显著上调的差异甲基化位点,与个体水平结果一致。【结论】热应激会引起奶牛GNAS基因启动子甲基化水平增加,GNAS基因是奶牛热应激DNA甲基化调控的潜在靶基因。