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葛欣竺,史宇星,王莎莎,刘智慧,蔡文杰,周敏,王世贵,唐斌
GE XinZhu, SHI YuXing, WANG ShaSha, LIU ZhiHui, CAI WenJie, ZHOU Min, WANG ShiGui, TANG Bin
摘要: 【目的】丙酮酸激酶(PYK)是一种调节性糖酵解酶,负责调节糖酵解和糖异生之间的平衡,所以具有重要的生理作用。本研究旨在通过分析异色瓢虫(Harmonia axyridis)3条HaPYK的序列结构,并结合RNA干扰技术,探讨HaPYK在瓢虫体内的生物学功能。【方法】基于从异色瓢虫全基因组中获得的3条HaPYK序列(被分别命名为HaPYK1-1、HaPYK1-2、HaPYK2),通过生物信息学方法分析其理化性质和序列结构,以及与其他昆虫之间的同源性。然后采用显微注射的方法将体外合成的dsRNA导入羽化第1天成虫体内,在注射后48和72 h分别收集试验材料,提取虫体总RNA后进行反转录,随后采用实时荧光定量PCR技术测定3个HaPYK的表达水平以评估RNA干扰效果,并检测与海藻糖代谢相关基因的表达水平,最后检测葡萄糖、糖原、海藻糖含量以及两种海藻糖酶的活性。【结果】HaPYK1-1、HaPYK1-2、HaPYK2的开放阅读框分别为1 350 、1 569 、1 656 bp;蛋白大小分别为449、522、551 aa,理论等电点分别为5.04、5.02、5.01。保守结构域预测得到,三条HaPYK均属于Pyruvate_kinase超家族。HaPYK二级结构主要是α-螺旋和无规则卷曲,另外也含有延伸链和β-转角。三条序列的寡聚物类型均为同源四聚体。系统进化树显示,HaPYK与同为鞘翅目的昆虫具有较近的亲缘关系,如马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)和赤拟谷盗(Tribolium castaneum)。另外,注射dsHaPYK1-1后,HaPYK1-2和HaTRE1-4的表达量显著下调,而HaPYK2、HaTRE1-1、HaTRE1-2、HaTRE2-like、HaTPS的表达量显著上调;注射dsHaPYK1-2后,HaTRE1-1、HaTRE1-2、HaTRE1-3、HaTRE1-5、HaTRE2、HaTPS的表达量显著增加;注射dsHaPYK2后,仅HaTRE1-1在48 h表现为显著上调,HaTRE1-3、HaTRE1-4、HaTRE1-5、HaTRE2、HaTRE2-like的表达量均下调。与对照组相比,在dsHaPYK1-2组中48 h时TRE1活性显著降低,海藻糖和糖原含量显著增加;在dsHaPYK1-1或dsHaPYK2中48 h时葡萄糖含量减少,72 h时葡萄糖、海藻糖含量增加及TRE2的酶活显著提高;在dsHaPYK2组48 h时,海藻糖显著减少,而糖原含量显著增加。【结论】异色瓢虫体内存在3个HaPYK,通过导入外源dsHaPYK能成功干扰靶标基因的表达水平,且抑制表达后海藻糖代谢会受到影响,但3个HaPYK的调控机制不尽相同。