中国农业科学 ›› 2010, Vol. 43 ›› Issue (2): 252-258 .doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2010.02.004
丁勇,常玮,刘小烛
DING Yong, CHANG Wei, LIU Xiao-zhu
摘要:
【目的】克隆甘蓝型油菜(Brassica napus)油体钙蛋白(caleosin)基因BnClo1,并进行原核表达研究。【方法】在获得甘蓝型油菜BnClo1基因全长cDNA的基础上,根据BnClo1基因编码区设计1对特异引物,以甘蓝型油菜种子总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约750 bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pTYB12中,构建融合表达载体pTYB12-BnClo1,转化到Escherichia coli ER2566(DE3)中进行表达。【结果】测序结果显示,RT-PCR获得的cDNA全长768 bp,包含完整的开放阅读框738 bp,编码245个氨基酸残基,caleosin分子量为28.1 kD。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,以20℃、4 mmol?L-1 IPTG诱导该基因表达效果最好,诱导产物为一个与理论值相符的83.1 kD的融合蛋白intein-caleosin。【结论】克隆了油菜BnClo1基因,并在大肠杆菌中进行了优化表达。为进一步纯化和鉴定目的蛋白,及研究其功能奠定了试验基础。