中国农业科学 ›› 2008, Vol. ›› Issue (12): 4092-4099 .doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2008.12.020
赵 英,牛建新
摘要：
【目的】搞清苹果茎痘病毒在梨树组织中的分布，为茎尖脱毒提供直接的理论依据和技术支撑。【方法】以库尔勒香梨茎尖、叶片为材料，利用非放射性标记物地高辛（DIG），通过RT-PCR反应体系，合成了苹果茎痘病毒的cDNA探针，利用核酸探针斑点杂交检测方法对该探针特异性及灵敏度进行验证。研究制作了适合原位PCR及原位杂交的石蜡切片，利用原位反转录酶聚合酶链式反应（IS-RT-PCR）技术检测石蜡切片组织中苹果茎痘病毒RNA的定位及分布，并对影响实验结果的重要因素进行优化。【结果】梨树中的苹果茎痘病毒RNA阳性信号主要位于叶片的叶肉细胞、茎尖的外围皮层组织及相应的初生维管束。蛋白酶K消化时间以20 min为宜，要获得良好的扩增效果，RT 反应体系中RNasin的量需大于0.2 U?μl-1，dNTPs大于0.4 mmol?L-1，SuperScriptⅡ在0.1～1.3 U?μl-1，引物在0.9 μmol?L-1以上。PCR反应体系中适宜的退火温度为60℃，循环35次，引物浓度应在0.8～1.2 μmol?L-1，LA Taq酶浓度大于0.5 U?100?μl-1。【结论】梨树茎尖顶端分生组织0.25 mm的区域为无病毒区域。
