过量表达棉花GhSAP1提高转基因烟草的耐盐性
丁林云, 张微, 王晋成, 田亮亮, 李妮娜, 郭琪, 杨淑明, 何曼林, 郭旺珍
南京农业大学农学院/作物遗传与种质创新国家重点实验室/教育部杂交棉创制工程研究中心,南京210095

通信作者:郭旺珍,E-mail:moelab@njau.edu.cn

联系方式:丁林云,E-mail:dinglinyun@njau.edu.cn。张微,E-mail:microweizhang@sina.com

丁林云和张微为同等贡献作者。

摘要

【目的】SAP(stress-associated protein)是一类涉及胁迫应答和调控的锌指蛋白。克隆并分析其对逆境胁迫应答的反应,为棉花抗逆育种提供候选基因。【方法】通过电子克隆方法并经RT-PCR验证获得棉花锌指蛋白基因GhSAP1,将带有目的基因的载体质粒通过PEG介导转化棉花叶肉原生质体细胞,瞬时表达分析其编码蛋白的特性及亚细胞定位信息。通过qRT-PCR技术分析目标基因的组织表达特征及非生物胁迫条件下的表达特性。通过农杆菌介导叶盘转化法,经组织培养获得转基因烟草进行异位表达,检测其与抗逆相关的生理指标,证明其提高植物抗逆能力。【结果】GhSAP1 ORF长度为543 bp,编码一条含180个氨基酸残基的多肽。其理论等电点8.97,分子量19.3 kD,具有典型的A20/AN1锌指结构域。亚细胞定位显示该基因编码的蛋白定位于细胞核上。不同组织器官表达分析显示,GhSAP1在根、茎、叶中的表达量高,而在开花后5 d的胚珠中表达量很低。GhSAP1受盐胁迫诱导,高盐处理2 h后表达量最高。利用含100 μg·mL-1Kan的培养基进行抗性筛选转基因后代,结合目标基因的PCR与RT-PCR验证,获得转GhSAP1的转基因烟草阳性株系10个。目标基因GhSAP1均能在烟草基因组中整合并异位过量表达。随机选择3个转基因烟草株系,盐胁迫处理显示,发芽一周的种子在含200 mmol·L-1 NaCl培养基上胁迫12 d,转基因植株幼苗平均成活率为81.7%,比非转基因对照植株增加近3倍,其平均根长为3.05 cm,极显著高于非转基因对照。利用GhSAP1表达较高的L2纯系进行成株期烟草盐胁迫处理30 d,转基因烟草后代的SOD活性和可溶性总糖含量增幅分别为23.89 U·g-1 FW和8.37 %,均显著高于非转基因对照;与未胁迫处理相比,转基因植株的叶绿素含量降低幅度仅为0.17 mg·g-1 FW,而非转基因对照降低了0.39 mg·g-1 FW;盐胁迫处理后,转基因植株的MDA含量增幅为7.42 nmol·g-1FW,而非转基因对照增幅达20.85 nmol·g-1FW;在盐胁迫下,转基因植株具有更强的K+根部运输到植株绿色组织能力,其地上部的K+/Na+为1.23,显著高于非转基因对照。【结论】GhSAP1在参与植物的逆境应答反应机制中具有重要作用,过量表达GhSAP1可显著提高转基因烟草的耐盐能力。

关键词: 棉花; GhSAP1; 超表达; 转基因烟草; 盐胁迫
Overexpression of aGossypium hirsutum Stress-Associated Protein Gene (GhSAP1) Improves Salt Stress Tolerance in Transgenic Tobacco
DING Lin-yun, ZHANG Wei, WANG Jin-cheng, TIAN Liang-liang, LI Ni-na, GUO Qi, YANG Shu-ming, HE Man-lin, GUO Wang-zhen
College of Agriculture, Nanjing Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Genetics & Germplasm Enhancement/Hybrid Cotton R & D Engineering Research Center, Ministry of Education, Nanjing 210095
Abstract

【Objective】Stress associated proteins (SAPs) is a type of novel stress response-inducing zinc finger proteins with A20/AN1 zinc-finger domain. The objectives of this study are to isolate a member of stress associated protein (SAP) gene family, analyze its responses to abiotic stress, and provide a potential candidate gene for improving abiotic stress tolerance in cotton by biotechnological approaches. 【Method】A cotton zinc protein geneGhSAP1 was isolated based on in silico cloning and confirmed by RT-PCR analysis, further, recombinant plasmid vector withGhSAP1 was transformed into purified cotton mesophyll protoplast mediated with PEG for elucidating the characteristics of encoded proteins and subcellular location by a transient expression system. The expression patterns ofGhSAP1 in different tissues and under salt stress were analyzed through real-time RT-PCR. By leaf disc method,Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, and tissue culture, different transgenic tobacco lines with high ectopic overexpression ofGhSAP1 were obtained, further, their determination of physiologic index related to abiotic stress was finished and the potential of improving abiotic stress tolerance in plant was elucidated. 【Result】GhSAP1 contained ORF length of 543 bp and encoded a polypeptide containing 180 amino acids with typical A20/AN1 zinc finger structural domain. The theoretical iso-electric point was 8.97 with a calculated molecular weight of 19.3 kD. Subcellular location showed that GhSAP1 was localized in cell nucleus. The expression patterns in different tissues and organs showed thatGhSAP1 expressed preferentially in root, stem, and leaf tissues, but the expression level was the lowest in young ovules at five days post anthesis.GhSAP1 was accumulated significantly when induced after 2 h under salt stress treatment. Ectopic overexpression ofGhSAP1 in tobacco plants was performed via leaf disc transformation mediated byAgrobacterium tumefaciens, and was confirmed in both genomic and transcriptional level by PCR and RT-PCR in transgenic tobacco seedlings. Ten tobacco transgenic lines were preliminarily obtained through resistance selection with 100 μg·mL-1 Kan culture medium for transgenic progeny, and confirmed by PCR and RT-PCR ofGhSAP1. The result showed thatGhSAP1 was integrated into tobacco genome validity with high ectopic overexpression. Further, three transgenic tobacco positive lines were selected by random and analyzed under salt stress. Treating the seedlings of germination for seven days using 200 mmol·L-1 NaCl, 12 days later, the average survival rate of transgenic tobacco lines was 81.7%, which was 3 times higher than those of wild-type plants, and the relative root length in transgenic plants was 3.05 cm in average, significantly higher than wild type plants. Further, L2 pure lines with higherGhSAP1 expression was selected to elucidate physiologic index related to abiotic stress. In detail, when treating the plants with 9 to 11 leaves using 200 mmol·L-1 NaCl, 30 days later, the transgenic lines overexpressingGhSAP1 showed better SOD activity and increased total soluble sugar content, with net increase value of 23.89 U·g-1 FW and 8.37 %, respectively, which was significantly higher than non-transgenic plants. Compared with non-stress treatment, the reduction of the chlorophyll content of transgenic plants was only 0.17 mg·g-1 FW, in contrast to the 0.39 mg·g-1 FW of the non-transgenic plants. After treatment under salt stress condition, the MDA content of transgenic plants only increased by 7.42 nmol·g-1 FW, however, the MAD content of the non-transgenic plants increased by 20.85 nmol·g-1 FW. Meanwhile, the transgenic plants had the better transport ability of K+ from plant root to green tissue, the K+/ Na+ ratio of above-ground part was 1.23, with higher transport ability compared with wild type plants.【Conclusion】It was concluded thatGhSAP1 plays an important role in response to salinity stress in plants, overexpression ofGhSAP1 can improve significantly tolerance to salt stress in transgenic tobacco plants.

Keyword: cotton; GhSAP1; overexpression; transgenic tobacco; salt stress
0 引言

【研究意义】干旱、高盐、极端温度、重金属等非生物胁迫是影响植物生长发育和农作物产量的重要因素,造成全世界作物产量损失30%—50%[ 1]。其中,高盐和干旱的威胁最严重[ 2, 3]。据统计,地球上比较适宜于栽种作物的土地不到10%,估计到2050年将有50%的可耕地面积严重盐渍化[ 4]。非生物胁迫能够导致植物发生一系列形态学、生理学、生物化学和分子水平的变化,影响植物的生长发育和产量[ 5]。当植物受到各种胁迫伤害后,将启动分子水平、细胞水平以及生理学的应答反应来适应胁迫环境,进而产生抗(耐)性反应[ 6]。因此,植物通过改变其基因的表达和代谢途径来适应多种逆境伤害。克隆并分析逆境胁迫应答相关基因及作用机制,可为植物抗逆育种提供候选基因。【前人研究进展】锌指蛋白是一类与锌离子结合并折叠成手指状结构的蛋白质总称,是转录因子数量最多的成员。锌指蛋白能够调控逆境相关基因表达,参与植物对生物和非生物胁迫的应答反应。目前,已在拟南芥( Arabidopsis thaliana[ 7]、水稻( Oryza sativa[ 8]、小麦( Triticum aestivum[ 9]、棉花( Gossypium hirsutum[ 10, 11]、大豆( Glycine max[ 12]等植物中报道了多个锌指蛋白基因。SAP(stress associated protein)是一类涉及胁迫应答和胁迫调控的锌指蛋白,其蛋白家族具有A20/AN1锌指结构域特征[ 13, 14]。在大多数被子植物中含有SAP基因家族的保守序列,已在拟南芥、玉米、毛果杨基因组中分别克隆了14、11、19个SAP基因[ 15]。水稻 OsSAP1是植物第一个被报道的AN1/A20型锌指蛋白,其受低温、干旱、高盐、湿涝、重金属、创伤和ABA等诱导,过量表达的转基因烟草可提高对低温、干旱和盐胁迫的耐受能力[ 16]。拟南芥 AtSAP5具有E3 泛素连接酶的功能,在根中优势表达并受高盐、干旱和低温等诱导,过量表达 AtSAP5能够增强转基因拟南芥植株的耐旱性[ 17]。马绊草中 AlSAP的表达受高温、高盐诱导,在高温与盐胁迫条件下转基因烟草表现较强的耐盐性与耐高温特性[ 18]。过量表达蒺藜苜蓿 MtSAP1转基因烟草植株,调控信号分子NO大量积累,在胁迫环境中表现极强的耐盐性[ 19]。【本研究切入点】棉花是重要的经济作物。由于棉花的种植地区受土地干旱、盐渍化等影响,严重威胁棉花的产量和品质。通过挖掘一系列抗逆相关基因,利用基因工程技术创制抗逆棉花新材料,可加速培育适应性强和产量高的棉花新品种进程。到目前为止,棉花逆境相关锌指蛋白特别是转录因子基因等功能研究较少,棉花SAP蛋白尚未报道。【拟解决的关键问题】本研究以水稻已报道的与逆境相关的SAP蛋白氨基酸序列为探针,通过扫描棉花EST数据库,电子拼接获得一个ORF完整的棉花同源EST序列,进而设计专化引物从陆地棉品种晋棉19中克隆到与逆境相关的SAP锌指蛋白基因 GhSAP1,在其结构及表达特征研究基础上,通过转基因烟草证明其过量表达可显著提高转基因烟草的耐盐能力,为棉花SAP类锌指蛋白基因的研究与利用提供参考依据。

1 材料与方法
1.1 试验材料

本试验所用材料为陆地棉耐逆品种晋棉19( Gossypium hirsutum L. cv. Jinmian 19),由山西省农业科学院棉花研究所提供,引进后,连续多年严格自交繁殖以保持其遗传的稳定性。烟草品种三生烟( Nicotiana tabacumL. cv. Samsun N N)由南京农业大学农学院棉花研究所保存。

当晋棉19幼苗生长至五六片真叶时,取其根、茎和叶组织,在植株生长盛花期,采集开花后5 d的胚珠纤维混合物。取样后,迅速置于液氮中速冻,-70℃冰箱保存。用于目标基因组织器官表达分析。

盐胁迫诱导处理选自生长有3—4片真叶的棉花幼苗,将小苗从营养钵中取出,洗去根上泥土,用200 mmol·L-1 NaCl溶液分别处理0、2、4、6、8、10、12和24 h。在不同诱导时间收集叶片组织,样品在液氮中速冻后于-70℃保存,用于目标基因盐胁迫诱导表达分析。

1.2 GhSAP1的获得与序列验证

利用水稻中已报道的与逆境相关的锌指蛋白 OsiSAP1(GenBank No. AF140722)氨基酸序列为探针,与陆地棉的dbEST数据库(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/)进行tBLASTN比对。将获得的EST序列用CAP3拼接后形成Contig,然后以Contig为探针,再次采用BLASTN方式进行检索,直至检出的Contig不能再延伸。对电子拼接获得的序列进行ORF 预测、BLASTP功能搜索和多重序列比较,将其分类命名。根据目标序列生物信息学分析结果,用Oligo 6软件分别设计扩增基因全长的引物和qRT-PCR引物(表1),进行目标基因全长序列测定和表达特征分析。PCR反应参数为94℃ 5 min;94℃ 30 s,56℃ 45 s,72℃ 90 s,循环32次;72℃ 10 min。PCR扩增产物经1.0 %琼脂糖凝胶电泳分离。所有引物合成和DNA序列测定均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

表1 本研究所用引物 Table 1 Primer pairs used in this study
1.3 生物信息学分析

利用NCBI中BLASTP程序在蛋白数据库中进行相似性搜索,获得测序片段的相关功能信息;利用DNAstar(Ver. 5.01)软件完成ORF,等电点和分子量预测;利用Clustal X(Ver 2.0.12)进行多重序列比对,利用MEGA5(http://www.megasoftware.net/)进行进化树分析。

1.4 实时荧光定量PCR反应

His3作为棉花内参基因,利用ABI实时荧光定量PCR仪(7500型)扩增分析,反应体系含2.0 μL 10×PCR buffer、1.2 μL 25 mmol·L-1 MgCl2、0.4 μL 10 mmol·L-1dNTP Mix、1 μL cDNA第一链模板、10 μmol·L-1正向引物和反向引物各0.5 μL、10 μL 2×SYBR(Roche)溶液和0.1 μL rTaq酶(5 U·μL-1,TaKaRa),加无菌超纯水至20 μL反应组分。扩增条件为95℃ 2 min;94℃ 45 s,55—60℃ 30 s,72℃ 30 s,40个循环;72℃ 10 min,以熔解曲线结束。采用2-ΔCt法进行数据的相对定量分析[ 20],计算公式如下,目的基因相对表达量=2-ΔCt;ΔCt=Ct目的基因-Ct,His3

1.5 GhSAP1瞬时表达分析

pJIT166-GFP质粒载体中含有绿色荧光蛋白,在真核细胞中高水平表达。将 GhSAP1采用Primer Premier 5.0软件设计两端带有 BamHⅠ和 PstⅠ酶切接头的引物F:5′-CGCGGATCCATGGCTCAAAGAA CCG 3′;R:5′-GCGCTGCAGAACTCTGATAATCTT GG 3′,将目的基因片段转入pJIT166-GFP中,插入位置为35S-P(启动子)与Nos-T(终止子)之间,构建融合蛋白表达载体pJIT166-GhSAP1-GFP。通过PEG4000介导将该载体导入棉花原生质体中,表达GhSAP1蛋白,以明确其在棉花细胞内的定位。

1.6 转 GhSAP1烟草的获得及分子检测

将测序验证为正确的 GhSAP1 cDNA克隆经 BamHⅠ和 SmaⅠ双酶切,连接到质粒pBI121中,构建含有 GhSAP1重组基因的过量表达载体pBI121-35S-GhSAP1。采用农杆菌介导叶盘转化法[ 21]获得转基因烟草植株。T0种子经消毒处理后用含100 μg·mL-1Kan的1/2MS培养基抗性筛选,得到转基因后代株系。分别提取T1转基因烟草植株的DNA和RNA,以基因组DNA为模板进行目标基因PCR扩增验证。以烟草 NtActin为内参基因[ 22]引物F:5′-TCCGG CGACGGTGTCTCACA-3′和R:5′-CGCGGACAATTT CCCGTTCAGC-3′调整模板,进行转基因烟草株系的目标基因RT-PCR表达分析。选取筛选鉴定的阳性植株幼苗移栽到营养土中继续生长以收获T2种子,从中筛选获得纯合转基因株系。

1.7 转基因烟草幼苗期耐盐性测定

选择T1转基因烟草3个不同转化株系L2、L3、L5和对照非转基因植株种子,经消毒处理后播种于含有100 μg·mL-1Kan的1/2MS培养基上进行阳性筛选,生长一周后将阳性转基因幼苗转移到含200 mmol·L-1NaCl的1/2MS培养基上继续生长12 d,观察转基因烟草与野生型幼苗的生长情况。以未转化烟草WT为对照,每个株系处理80粒种子,挑取60株阳性幼苗,进行盐胁迫下幼苗成活率检测。每个处理设置3个重复。种子相对根长(%)=(胁迫条件下的根长/未处理条件下根长)×100%,幼苗相对成活率(%)=(胁迫条件下成活率/未处理成活率)×100%。

1.8 转基因烟草成株期耐盐性测定

GhSAP1过量表达阳性转基因T2种子L2克隆系为材料,未转化烟草WT为对照,12 h光照/12 h黑暗自然生长至9—11叶片进行盐胁迫逆境处理。以200 mmol·L-1的NaCl盐水每4—5 d浇灌一次,共处理30 d。取烟草叶片测定叶绿素含量[ 23]、蔗糖和可溶性总糖、SOD活性[ 24]、MDA含量以及K+、Na+离子含量。每个试验设置3个重复,调查转基因烟草和非转基因对照的相关指标值。

2 结果
2.1 GhSAP1克隆及序列特征分析

以水稻逆境相关锌指蛋白基因 OsiSAP1(GenBank No.:AF140722)氨基酸序列为探针,搜索陆地棉EST数据库进行同源比对分析,通过电子拼接克隆,获得该候选基因最大ORF。进一步设计扩增全长ORF的引物,以陆地棉品种晋棉19叶片组织cDNA为模板,扩增目标片段并测序验证,获得一个含完整ORF的cDNA序列。其ORF长度为543 bp,编码180个氨基酸。该基因为陆地棉锌指蛋白家族新成员,属于SAP亚家族,因此,将其命名为 GhSAP1 Gossypium hirsutumL. SAP1,GenBank No.:KF751646)。

GhSAP1理论等电点为8.97,分子量为19.3 kD,典型的A20/AN1锌指结构域。其N端具有一个Cys2/Cys2锌指,位于18—42氨基酸之间具有明显的A20结构域;C端121—158氨基酸序列间具有AN1结构域(图1)。进一步对其蛋白质结构预测分析发现,GhSAP1活性可能受磷酸化和去磷酸化的调节,参与调节植物体内其他基因的表达。

图1 GhSAP1编码蛋白A20/AN1锌指结构域Fig. 1 Putative A20/ AN1 zinc finger functional domain of GhSAP1

2.2 GhSAP1系统进化分析

为进一步明确棉花GhSAP1与其他植物中其同源基因的进化关系,将棉花的GhSAP1同已报道的其他植物SAP家族基因进行氨基酸序列比较及同源进化树分析[ 18, 25, 26, 27]。从NCBI 网站中搜索了番茄( Solanum lycopersicum)、水稻( Oryza sativa L.)、潘那利番茄( Solanum pennellii)、獐茅( Aeluropus sinensis)等SAP类基因,与新克隆的GhSAP1分别进行氨基酸的多重序列比较和系统进化分析。结果表明, GhSAP1与已报道的水稻胁迫相关锌指蛋白基因 OsiSAP1(GenBank No.:NP_001063521)的亲缘关系最近,同源性为48%(图2-A);且在结合锌离子的关键氨基酸部位保守性非常高(图2-B)。

图2 棉花GhSAP1与其他物种同源基因的氨基酸序列比较和进化树分析Fig. 2 Comparison of GhSAP1 zinc finger domain and other zinc-finger proteins from different species and their phylogenetic tree analysis

2.3 GhSAP1棉花原生质体亚细胞定位

以pJIT166-GFP质粒载体为对照,将含有 GhSAP1和报告基因的融合表达载体与对照载体分别转入棉花叶肉原生质体细胞,进行目标基因的亚细胞定位。结果显示,不含 GhSAP1的对照质粒转化棉花原生质体细胞后,其细胞核、胞质和细胞膜等部位均有明显荧光信号,GFP蛋白分布在整个细胞中;而转化GhSAP1:GFP融合载体质粒DNA仅在原生质体细胞核上具有明显的绿色荧光信号(图3)。研究表明,与其他植物TFⅢA(C2H2)型锌指蛋白相似,该类蛋白含有与亚细胞定位相关的特定核定位信号[ 28],转录因子GhSAP1编码产物定位于植物细胞的细胞核上行使功能。

图3 GhSAP1的亚细胞定位Fig. 3 Subcellular location of GhSAP1

2.4 GhSAP1的表达与诱导表达分析

分别提取晋棉19的叶、根、茎和开花后5 d纤维胚珠混合物等样品总RNA,并反转成cDNA,以棉花组成性表达的看家基因 His3为参照,分析 GhSAP1在供试组织器官中的表达特征。结果表明, GhSAP1在开花后5 d纤维胚珠组织中表达量很低,而在根、茎和叶中的表达量均很高,它们相互间的表达水平无显著差异,说明 GhSAP1主要在根、茎和叶等营养器官中优势表达。分别提取晋棉19幼苗在200 mmol·L-1 NaCl胁迫处理下,0、2、4、6、8、10、12和24 h等不同时期的叶片总RNA为模板,以棉花持家基因 His3为内标,进行 GhSAP1盐胁迫的诱导表达分析。在盐处理2 h后, GhSAP1转录本显著增强,极显著高于0 h的表达水平(图4)。随着胁迫时间延长,其表达水平与未处理比较基本一致,无统计学差异。表明 GhSAP1在盐胁迫下表现快速应急反应,能迅速抵抗胁迫的影响。

图4 GhSAP1在高盐胁迫下的表达特征Fig. 4 Expression pattern of GhSAP1 under salt stresses

2.5 过量表达 GhSAP1转基因烟草的获得与分子鉴定

利用农杆菌介导目的基因载体转化烟草叶盘,创制过量表达棉花 GhSAP1的转基因烟草转化材料。转基因T0种子用含100 µg·mL-1Kan的1/2MS培养基进行抗性筛选,共获得10个T0转基因烟草阳性株系。分别将不同克隆系T0单株上收获的T1种子进一步在Kan抗性培养基上筛选,阳性植株移入土培种植。对上述10个不同来源的克隆系分别提取其叶片DNA,进行目标基因基因组整合检测分析。结果显示,其中8个克隆系均PCR扩增出与质粒阳性载体对照一致的目的片段,大小为591 bp。目标扩增产物进一步测序验证正确。

随机选择T1转基因烟草3个株系L2、L3、L5,每个克隆系选择3个单株,分别提取其叶片DNA和RNA,进一步分析目标基因的基因组及转录表达分析。PCR扩增转 GhSAP1烟草3个转基因株系的9个转基因单株,均获得清晰的目标扩增带,而野生型烟草及阴性对照没有扩增出条带(图5-A)。RT-PCR转录水平检测,在烟草内参 NtActin稳定表达的情况 下,野生型烟草没有扩增出 GhSAP1,而3个转基因株系都扩增出了目标产物(图5-B)。以上结果表明 GhSAP1整合到烟草的基因组中,并且在转基因后代中正确转录表达。

图5 转基因烟草的PCR和RT-PCR检测Fig. 5 PCR and RT- PCR detection in different transgenic tobacco lines

2.6 转基因烟草耐盐性检测

2.6.1 转基因 GhSAP1烟草幼苗在高盐胁迫下成活率及根长测定 为了研究 GhSAP1在提高烟草耐盐性中作用,对转基因烟草进行盐胁迫下幼苗成活率分析。以野生型为对照,选择T1的L2、L3和L5三个阳性克隆系发芽一周后的转基因烟草幼苗分别转接于含200 mmol·L-1 NaCl的1/2MS培养基上培养,生长12 d后,对照烟草幼苗出现萎黄与白化,而转基因烟草株系受盐胁迫影响较小,叶片保持绿色并能正常生根(图6-A);转基因烟草株系的成活率分别为94.21%(L2),81.40%(L3)和69.56%(L5)。其平均成活率为81.7%,而对照非转基因烟草WT成活率只有28.1%;转基因烟草株系的平均成活率比对照植株提高近3倍(图6-B)。

图6 盐胁迫下转基因烟草幼苗的发芽率Fig. 6 Germination rate of three transgenic tobacco lines under salt stress

与野生型烟草相比,转基因烟草无论在正常生长和盐胁迫条件下,其根长均显著高于对照,显示其较好的生长优势及耐胁迫能力(图7-A)。在正常生长的培养基上培养12 d后,与对照3.87 cm的根长相比,3个转基因株系的根长均显著高于对照,分别为5.48 cm(L2)、4.88 cm(L3)和4.54 cm(L5);而在200 mmol·L-1盐浓度胁迫下,不同转基因株系与对照的根长生长均受到抑制,但野生型烟草抑制更明显。其中,野生型烟草的根长为1.43 cm,而3个转基因株系的根长分别为3.2 cm(L2)、3.1 cm(L3)和2.86 cm(L5)。其平均根长为3.05 cm,是野生型烟草相对根长的2倍多(图7-B)。

图7 盐胁迫下转基因烟草幼苗的相对根长Fig. 7 Relative root length of three transgenic tobacco lines under salt stress

上述结果表明,高盐胁迫影响了植株的正常生长发育,过量表达转基因 GhSAP1的转基因烟草后代表现显著提高的幼苗成活率和根伸长能力,在幼苗期表现较高的耐盐特性。

2.6.2 转基因烟草成株期耐盐性生理指标检测 与转基因烟草L3和L5克隆系相比,盐胁迫下L2的幼苗成活率最高,表现更强的耐盐能力。因此,选取L2的T2转基因阳性株系和非转基因对照进行成株期盐胁迫处理,分析其叶绿素含量、MDA含量、可溶性总糖含量、SOD活性和K+/Na+等耐盐相关指标。与对照水处理相比,200 mmol·L-1NaCl胁迫处理30 d后,野生型烟草的叶绿素含量由0.87 mg·g-1FW降低到0.48 mg·g-1 FW,而转 GhSAP1植株的含量由0.83 mg·g-1FW降低到0.66 mg·g-1FW(图8-a),说明盐处理虽然显著降低了烟草的光合作用,但相对于野生型烟草而言,盐处理对转基因植株叶片光合作用的影响较小;SOD活性测定表明,野生型烟草的SOD活性由59.65 U·g-1FW升高到68.09 U·g-1FW,而转 GhSAP1植株的活性由59.07 U·g-1FW提高到82.96 U·g-1FW,显著高于野生型植株(图8-b);野生型植株的MDA含量由19.78 nmol·g-1FW升高到40.63 nmol·g-1FW,而转基因植株的含量由19.91 nmol·g-1FW升高到27.33 nmol·g-1FW(图8-c),说明在盐处理下植株的质膜氧化程度加剧,MDA含量显著升高,但相对于野生型烟草,转基因植株的氧化程度较低;在盐处理下,对照植株与转化植株后代的可溶性糖积累均有所增加,特别是转基因植株的含量由14.45%上升到22.82%,显著高于对照增加程度(图8-d);K+/Na+测定结果显示,在盐胁迫下转基因植株具有更强的K+根部运输到植株绿色组织能力,可有效进行离子调节,保证营养平衡。其地下部与地上部的K+/Na+分别为0.45和1.23。而野生型烟草极少由地下部转移至到地上部(图8-e)。

图8 盐胁迫对野生型和转 GhSAP1转基因烟草相关生理指标分析Fig. 8 Detection of related physiological index between non-transgenetic tobacco and transgenetic tobacco line under salt stress

综上所述,过量表达 GhSAP1的烟草转基因植株,其耐盐能力显著提高。

3 讨论

植物在长期的进化过程中,形成了一系列的应答保护机制,通过植物细胞内基因表达变化来实现和调节胁迫应答反应。锌指蛋白因能结合锌离子并可折叠成手指状而得名,是自然界中成员最多的转录因子家族之一。C2H2 型锌指蛋白是典型的双锌指结构,与各种非生物胁迫应答相关,如高盐诱导的拟南芥和水稻锌指蛋白基因ZAT10、RZF71[ 29, 30];大豆耐冷锌指蛋白SCTF-1[ 31]等。SAP锌指蛋白属于A20/AN1双锌指蛋白,在动物免疫应答和植物胁迫反应中均起非常重要作用。研究证明,A20/AN1锌指蛋白是植物逆境信号通路中的上游调控因子,通过抑制或激活信号传递相关蛋白进而调控下游基因表达。在哺乳动物类细胞中,A20/AN1锌指蛋白通过依赖去泛素化酶活性机制来调节转录因子NF-κB活性,从而调整细胞敏感性和细胞凋亡[ 32]。尽管SAP锌指蛋白具有潜在的功能重要性,但植物SAP蛋白家族的作用机制和调控模式研究还很少[ 17]。拟南芥、水稻和獐茅中的SAP结构及功能研究已有相关报道[ 16, 17, 18]。过量表达水稻 OsiSAP1的转基因烟草,对低温、干旱和盐胁迫的耐受能力显著增强[ 16]。拟南芥中的大多数SAP基因均涉及非生物胁迫应答[ 17],如拟南芥 AtSAP12受冷和盐胁迫诱导,胁迫6 h后表达水平显著提高,24 h和48 h后降低,AtSAP12蛋白含量也有所下降[ 33]。獐茅 AlSAP的表达受高盐、干旱、冷冻、高温及ABA和SA诱导增强,过表达 AlSAP可提高烟草的抗旱和耐盐能力[ 18]。水稻 OsiSAP8是一个多种胁迫诱导型基因,在烟草和水稻中过量表达 OsiSAP8都能提高对盐、干旱和冷胁迫的耐受性[ 34]。在本研究中,从耐逆境的棉花品种晋棉19中克隆了 GhSAP1,其表达受高盐迅速诱导,在胁迫2 h后表达量极显著提高。与近缘物种中同源基因比较,该类基因编码的氨基酸具有保守的结构域,且在结合锌离子的关键氨基酸部位保守性更高,具有相似的潜在功能。

植物在遭受盐害逆境胁迫时会发生一系列生理生化变化,盐、干旱或病害胁迫会诱导细胞内积累大量的活性氧,导致细胞膜脂不饱和脂肪酸过氧化,破坏生物膜整体流动性、通透性和完整性,继而诱发植物细胞的凋亡[ 35]。SOD有利于保护细胞内的蛋白和膜系统免受氧化胁迫的伤害,增强植物在高盐环境下的适应能力。鲁燕等[ 36]利用200 mmol·L-1NaCl处理过量表达 W6的转基因烟草材料,测得其转基因材料SOD酶活性是非转基因对照的2倍。前人报道不同株系的转基因后代存在拷贝数多寡及整合位点差异,导致表达水平差异[ 37]。本研究采用农杆菌介导组织培养方法,获得了10个不同来源的转基因烟草后代株系。尽管未做转基因株系的外源基因拷贝数分析,但在基因组和转录水平的分子检测证实10个转基因株系中棉花 GhSAP1均稳定整合到烟草的基因组中,并且在转基因后代中高效表达。选择外源基因表达水平较高的T1转基因烟草株系进行耐逆性生理指标检测,发现在高盐胁迫下,过表达棉花 GhSAP1烟草植株的SOD活性和可溶性总糖的水平均显著高于野生型,表现出较强的耐盐特性。

高盐胁迫下,种子出苗率和立苗率也能较好反应其耐盐水平。智冠华等[ 22]获得转沙冬青锌指蛋白基因 AmZFPG的转基因烟草,通过叶盘浸泡、种子发芽率试验均证实转 AmZFPG烟草比对照有显著高的发芽率,显示极强的耐盐性。本研究获得的过表达棉花 GhSAP1烟草植株,在高盐胁迫下,幼苗期种子发芽率和成活率均显著高于非转基因野生型对照。 GhSAP1是一个改善植物耐盐性的候选基因,有望通过转基因技术提高该基因表达水平进而增强植物耐盐能力。

棉花是世界性的重要经济作物,其中,陆地棉占全球棉花种植面积的95%以上。中国耕地面积有限,同时保证粮棉油安全供给的矛盾日益突出,需充分、有效利用大面积的滩涂、盐碱地,拓展土地可利用资源,提高土地利用率。作为盐碱地的先锋作物,棉花在盐碱地的有效利用和改良上均可发挥重要作用。有效发掘耐盐相关基因,通过转基因等功能验证阐明其在盐胁迫中调控机制和作用能力,可有效用于耐盐棉花新品种培育研究。最近,棉花基因组测序获得较大进展,国际2个不同研究小组均报道完成二倍体雷蒙德氏棉基因组测序及组装工作[ 38, 39],而二倍体亚洲棉及四倍体棉种的基因组测序工作也正有序开展[ 40]。基于序列信息,从分子水平上快速发掘棉花抗逆相关基因,研究其作用网络,揭示棉花对逆境胁迫信号传导及基因表达调控的分子机制,进而利用分子育种技术创制抗逆棉花新材料,有望大大加速棉花抗逆新品种的培育进程。

4 结论

从耐逆陆地棉品种晋棉19中克隆出编码锌指蛋白的 GhSAP1,其编码的氨基酸具有明显的AN1/A20锌指结构域,亚细胞定位于细胞核上。 GhSAP1主要在营养器官中优势表达,在盐胁迫诱导2 h后表达显著增强。在高盐胁迫下,过量表达 GhSAP1的转基因烟草幼苗相对发芽率和成活率均明显高于野生型。其可溶性总糖含量、SOD活性均显著提高,抗氧化能力增强,保持叶绿素含量及K+/Na+平衡水平均显著高于非转基因对照。过量表达 GhSAP1显著提高转基因烟草的耐盐能力。 GhSAP1可作为棉花抗逆育种的基因源。

The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。

参考文献
[1] Vinocur B, Altman A. Recent advances in engineering plant tolerance to abiotic stress: Achievements and limitations. Current Opinion in Biotechnology, 2005, 16(2): 123-132. [本文引用:1] [JCR: 7.86]
[2] Kanneganti V, Gupta A K. Over-expression of OsiSAP8, a member of stress associated protein (SAP) gene family of rice confers tolerance to salt, drought and cold stress in transgenic tobacco and rice. Plant Molecular Biology, 2008, 66: 445-462. [本文引用:1] [JCR: 3.518]
[3] Poltronieri P, onsegna S, Domenico S D, Santino A. Molecular mechanisms in plant abiotic stress response. Stress Physiology, 2011, 48: 15-24. [本文引用:1]
[4] Cattivelli L, Baldi P. Chromosome regions and stress related sequences in volved in resistance to abiotic stress in Triticeae. Plant Molecular Biology, 2002, 48: 649-665. [本文引用:1] [JCR: 3.518]
[5] 杨献光, 梁卫红, 齐志广, 马闻师, 沈银柱. 植物非生物胁迫应答的分子机制. 麦类作物学报, 2006, 26(6): 158-161.
Yang X G, Liang W H, Qi Z G, Ma W S, Shen Y Z. Molecular mechanisms of plant responses to abiotic stresses. Journal of Triticeae Crops, 2006, 26(6): 158-161. (in Chinese) [本文引用:1] [CJCR: 1.007]
[6] Huang J, Sun S, Xu D, Lan H, Sun H, Wang Z, Bao Y, Wang J, Tang H, Zhang H. A TFIIIA-type zinc finger protein confers multiple abiotic stress tolerances in transgenic rice (Oryza sativa L. ). Plant Molecular Biology, 2012, 80: 337-350. [本文引用:1] [JCR: 3.518]
[7] Dixit A R, Dhankher O P. A novel stress-associated protein‘AtSAP10from Arabidopsis thaliana confers tolerance to nickel, manganese, zinc, and high temperature stress. Plos One, 2011, 6(6): e20921. [本文引用:1] [JCR: 3.73]
[8] Jun H, Lin T, Li X L, Ting L, LianY L, DanY C, Liang G X, Zhong H Z, Hong B S. NF216 is an A20-like and IkappaB kinase gamma interacting inhibitor of NF kappa Bactivation. The Journal of Biological Chemistry, 2004, 279: 16847-16853. [本文引用:1] [JCR: 0.433]
[9] 倪志勇, 徐兆师, 刘丽, 李连城, 柴岩, 陈明, 马有志. 小麦转录因子TaDREB6基因的克隆及鉴定. 麦类作物学报, 2008, 28(3): 357-363.
Ni Z Y, Xu Z S, Liu L, Li L C, Chai Y, Chen M, Ma Y Z. Isolation and characterization of a transcription factor TaDREB6 gene from Triticum aestivum L. Journal of Triticeae Crops, 2008, 28(3): 357-363. (in Chinese) [本文引用:1] [CJCR: 1.007]
[10] 王东, 杨金水. 棉花类耐盐锌指蛋白基因的克隆与结构分析. 复旦学报: 自然科学版, 2002, 41(1): 42-46.
Wang D, Yang J S. Clonging and characterization of cDNA encoding cotton STZ-like protein. Journal of Fudan University: Natural Science, 2002, 41(1): 42-46. (in Chinese) [本文引用:1]
[11] 杨郁文, 周建武, 张保龙, 范晓慧, 任永哲, 陈天子. 棉花SUPERMAN类锌指蛋白基因GZFP的启动子及功能分析. 棉花学报, 2011, 23(6): 483-489.
Yang Y W, Zhou J W, Zhang B L, Fan X H, Ren Y Z, Chen T Z. Functional analysis of the superman-like zinc finger protein gene GZFP and its promoter. Cotton Science, 2011, 23(6): 483-489. (in Chinese) [本文引用:1] [CJCR: 1.462]
[12] 宋冰, 王丕武, 付永平, 范旭红, 夏海峰, 高玮, 洪洋, 王贺, 张卓, 马建. 大豆C2H2型锌指蛋白基因SCTF-1的克隆及功能分析. 遗传, 2012, 34(6): 749-756.
Song B, Wang P W, Fu Y P, Fan X H, Xia H F, Gao W, Hong Y, Wang H, Zhang Z, Ma J. Cloning and functional analysis of SCTF-1 encoding a C2H2-type zinc finger protein from soybean. Hereditas, 2012, 34(6): 749-756. (in Chinese) [本文引用:1] [CJCR: 0.928]
[13] 王瑛华, 王小菁. 胁迫相关蛋白(SAP)与植物的抗逆性. 华南师范大学学报: 自然科学版, 2011(10): 9-12.
Wang Y H, Wang X Q. Relationship between stress associated proteins and stress tolerance in plants. Journal of South China Normal University: Natural Science Edition, 2011(10): 9-12. (in Chinese) [本文引用:1] [CJCR: 0.5046]
[14] Dixit V M, Green S, Sarma V, Holzman L B, Wolf F W, O'Rourke K, Ward P A, Prochownik E V. Tumor necrosis factor induction of novel gene products in human endothelial cells including a macrophage specific chemotaxin. Journal of Biological Chemistry, 1990, 265(5): 2973-2978. [本文引用:1] [JCR: 4.651]
[15] Vij S, Tyagi A K. A20/AN1zinc-fingerdomain-containing protein sinplants and animals represent common elements in stress response. Functional & Integrative Genomics, 2008, 8: 301-307. [本文引用:1]
[16] Mukhopadhyay A, Vij S, Tyagi A K. Over-expression of a zinc-finger protein gene from rice confers tolerance to cold, dehydration, and salt stress in transgenic tobacco. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 2004, 101: 6309-6314. [本文引用:3]
[17] Kang M, Fokar M, Abdelmageed H, Allen R D. Arabidopsis SAP5 functions as a positive regulator of stress responses and exhibits E3 ubiquitin ligase activity. Plant Molecular Biology, 2011, 75: 451-466. [本文引用:4] [JCR: 3.518]
[18] Saad R B, Zouari N, Ramdhan W B, Azaza J, Meynard D, Guiderdoni E, Hassairi A. Improved drought and salt stress tolerance in transgenic tobacco over-expressing a novel A20/AN1 zinc-finger “AlSAP”gene isolated from the halophyte grass Aeluropus littoralis. Plant Molecular Biology, 2009, 72(1/2): 171-190. [本文引用:4] [JCR: 3.518]
[19] Charrier A, Planchet E, Cerveau D, Gilles G C, Verdu I, Limami A M, Lelievrs E. Over-expression of a medicago truncatula stress-associated protein gene (MtSAP1) leads to nitric oxide accumulation and confers osmotic and salt stress tolerance in transgenic tobacco. Planta, 2012, 236: 567-577. [本文引用:1] [JCR: 3.347]
[20] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitatve PCR and the 2(-delta deltaC(t)) method. Method, 2001, 25: 402-408. [本文引用:1]
[21] 赵莉, 钟鸣, 马慧, 李浩戈, 陈丽静, 钟声. 农杆菌介导的烟草高效遗传转化体系的建立, 江苏农业科学, 2011, 39(3): 67-68.
Zhao L, Zhong M, Ma H, Li H G, Chen L J, Zhong S. Establishment of efficient genetic transformation system mediated by Agrobacterium tumefaciens in tobacco. Jiangsu Agriculture Science, 2011, 39(3): 67-68. (in Chinese) [本文引用:1] [CJCR: 0.895]
[22] 智冠华, 史军娜, 赵晓鑫, 刘胜利, 陈玉珍, 卢存福. 转沙冬青锌指蛋白基因AmZFPG烟草非生物胁迫抗性分析. 园艺学报, 2013, 40(4): 713-723.
Zhi G H, Shi J N, Zhao X X, Liu S L, Chen Y Z, Lu C F. Over-expression of a zinc-finger protein gene AmZFPG from Ammopiptanthus mongolicus confers tolerance to cold, drought and salt stress in transgenic tobacco. Acta Horticulturae Sinica, 2013, 40(4): 713-723. (in Chinese) [本文引用:2] [CJCR: 1.194]
[23] Tang M, Sun J, Liu Y, Chen F, Shen S. Isolation and functional characterization of the JcERF gene, a putative AP2/EREBP domain-containing transcription factor, in the woody oil plantJatropha curcas. Plant Molecular Biology, 2007, 63: 419-428. [本文引用:1] [JCR: 3.518]
[24] Wang R, Chen S, Ma H, Liu L, Li H, Weng H, Hao Z, Yang S. Genotypic differences in antioxidative stress and salt tolerance of three poplars under salt stress. Frontiers of Forestry in China, 2006, 1: 82-88. [本文引用:1]
[25] Vij S, Tyagi A K, Tyagi. Genome-wide analysis of the stress associated protein (SAP) gene family containing A20/AN1 zinc-finger(s) in rice and their phylogenetic relationship with Arabidopsis. Molecular Genetics and Genomics, 2006, 276: 565-575. [本文引用:1] [JCR: 2.881]
[26] Solanke A U, Sharma M K, Tyagi A K, Sharma A K. Characterization and phylogenetic analysis of environmental stress-responsive SAP gene family encoding A20/AN1 zinc finger proteins in tomato. Molecular Genetics and Genomics, 2009, 282: 153-164. [本文引用:1] [JCR: 2.881]
[27] Huang J, Wang M M, Jiang Y, Bao Y M, Huang X, Sun H, Xu D Q, Lan H X, Zhang H S. Expression analysis of rice A20/AN1-type zinc finger genes and characterization of ZFP177 that contributes to temperature stress tolerance. Gene, 2008, 420: 135-144. [本文引用:1] [JCR: 2.196]
[28] 黄骥, 张红生. TFⅢA型锌指蛋白及在提高植物耐逆性中的作用. 遗传, 2007, 29(8): 915-922.
Huang J, Zhang H S. The plant TFIIIA-type zinc finger proteins and their roles in abiotic stress tolerance. Hereditas, 2007, 29(8): 915-922. (in Chinese) [本文引用:1] [CJCR: 0.928]
[29] Sakamoto H, Araki T, Meshi T, Iwabuchi M. Expression of a subset of the Arabidopsis Cys2/His2-type zinc-finger protein gene family under water stress. Gene, 2000, 248(1/2): 23-31. [本文引用:1] [JCR: 2.196]
[30] 郭书巧, 黄骥, 江燕, 张红生. 水稻C2H2型锌指蛋白基因RZF71的克隆与表达分析. 遗传, 2007 , 29(5): 607-613.
Guo S Q, Huang J, Jiang Y, Zhang H S. Cloning and characterization of RZF71 encoding a C2H2-type zinc finger protein from rice. Hereditas, 2007, 29(5): 607-613. (in Chinese ) [本文引用:1] [CJCR: 0.928]
[31] 李晓君, 蔡文伟, 张树珍, 许莉萍, 陈萍, 王俊刚. 甘蔗锌指蛋白基因ShSAP1的克隆与表达模式. 生物工程学报, 2011, 27(6): 868-875.
Li X J, Cai W W, Zhang S Z, Xu L P, Chen P, Wang J G. Cloning and expression pattern of a zinc finger protein gene ShSAP1 in Saccharumofficinarum. Chinese Journal of Biotechnology, 2011, 27(6): 868-875. (in Chinese ) [本文引用:1] [CJCR: 0.917]
[32] Ying J, Meng W, Jun J F, Ning X, Yun Z, Yun L, Zhi W J, Jun Z, Guo Y W. Phylogenetic and expression analysis of ZnF-AN1 genes in plants. Genomics, 2007, 90: 265-275. [本文引用:1] [JCR: 3.01]
[33] Ströher E, Wang X J, Roloff N, Klein P, Husemann A, Dietz K J. Redox dependent regulation of the stress induced zinc finger protein SAP12 in Arabidopsis thaliana. Molecular Plant, 2009, 2: 357-367. [本文引用:1] [JCR: 6.126] [CJCR: 0.9487]
[34] Chen Z J. Ubiquitin signalling in the NF-κappaB pathway. Nature Cell Physiology, 2005, 7(8): 758-765. [本文引用:1]
[35] Sairam R K, Srivastava G C, Agarwal S, Meena R C. Differences in antioxidant activity in response to salinity stress in tolerant and susceptible wheat genotypes. Biologia Plantarum, 2005, 49(1): 85-91. [本文引用:1] [JCR: 1.692]
[36] 鲁燕, 徐兆师, 张瑞越, 刘丽, 李连城, 陈明, 叶兴国, 陈耀锋, 马有志. W6基因的过表达提高转基因烟草的耐盐性. 作物学报, 2008, 34(6): 984-990.
Lu Y, Xu Z S, Zhang R Y, Liu L, Li L C, Chen M, Ye X G, Chen Y F, Ma Y Z. Overexpression of W6 gene increases salt tolerance in transgenic tobacco plants. Acta Agronomica Sinica, 2008, 34(6): 984-990. (in Chinese) [本文引用:1] [CJCR: 1.667]
[37] 杨晓杰, 刘传亮, 张朝军, 武芝霞, 张雪妍, 刘坤, 房卫平, 李付 广. 不同转化方法获得的转基因棉花外源基因拷贝数分析. 农业生物技术学报, 2011, 19(2): 221-229.
Yang X J, Liu C L, Zhang Z J, Wu Z X, Zhang X Y, Liu K, Fang W P, Li F G. Comparative analysis of exogenous gene copy numbers in transgenic cotton transformed by different methods. Journal of Agricultural Biotechnology, 2011, 19(2): 221-229. (in Chinese) [本文引用:1] [CJCR: 0.635]
[38] Paterson A H, Wendel J F, Gundlach H, Guo H, Jenkins J, Jin D, Llewellyn D, Showmaker K C, Shu S, Udall J, Yoo M, Byers R, Chen W, Doron-Faigenboim A, Duke M V, Gong L, Grimwood J, Grover C, Grupp K, Hu G, Lee T, Li J, Lin L, Liu T, Marler B S, Page J T, Roberts A W, Romanel E, Sand ers W S, Szadkowski E, Tan X, Tang H, Xu C, Wang J, Wang Z, Zhang D, Zhang L, Ashfari H, Bedon F, Bowers J E, Brubaker C L, Chee P W, Das S, Gingle A R, Haigler C H, Harker D, Hoffmann L V, Hovav R, Jones D C, Lemke C, Mansoor S, Rahman M, Rainville L N, Rambani A, Reddy U K, Rong J, Saranga Y, Scheffler B E, Scheffler J A, Stelly D M, Triplett B A, Deynze A V, Vaslin M F S, Waghmare V N, Walford S, Wright R J, Zaki E A, Zhang T, Dennis E S, Mayer K F X, Peterson D G, Rokhsar D S, Wang X, Schmutz J. Repeated polyploidization of Gossypium genomes and the evolution of spinnable cotton fibres. Nature, 2012, 492(7429): 423-427. [本文引用:1] [JCR: 38.597]
[39] Wang K B, Wang Z W, Li F G, Ye W W, Wang J Y, Song G L, Yue Z, Cong L, Shang H H, Zhu S L, Zou C S, LI Q, Yuan Y L, Lu C R, Wei H L, Gou C Y, Zheng Z Q, Yin Y, Zhang X Y, Liu K, Wang B, Song C, Shi N, Kohel R J, Percy R G, Yu J Z, Zhu Y X, Wang J, Yu S X. The draft genome of a diploid cotton Gossypium raimondii. Nature Genetics, 2012, 44: 1098-1103. [本文引用:1] [JCR: 35.209]
[40] Zhu Y X, Li F G. The Gossypium raimondii genome, a huge leap forward in cotton genomics. Journal of Integrative Plant Biology, 2013, 55(7): 570-571. [本文引用:1] [JCR: 3.75] [CJCR: 0.7555]